2023, Vol. 52文章信息
- 刘彤崴, 李良, 王卓, 陈静
- LIU Tongwei, LI Liang, WANG Zhuo, CHEN Jing
- miR-183-5p和NDUFA4L2在肾透明细胞癌中的表达及相关性
- Expressions of miR-183-5p and NDUFA4L2 in renal clear cell carcinoma and their correlation
- 中国医科大学学报, 2023, 52(4): 327-332
- Journal of China Medical University, 2023, 52(4): 327-332
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文章历史
- 收稿日期：2022-09-09
- 网络出版时间：2023-04-12 15:45:31
引用本文 |
2. 锦州医科大学附属第三医院泌尿外科, 辽宁 锦州 121000
2. Department of Urology, The Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China
肾透明细胞癌是泌尿系统的常见恶性肿瘤之一，需行手术和内科治疗。尽管当前的治疗手段取得了重大进步，但未从根本上解决术后复发和转移等相关问题。基因异常表达是肾肿瘤发生和进展的重要分子遗传因素。微RNA（microRNA，miRNA）是近年学者关注的非编码RNA，其特征是通过与靶基因的3’非翻译区（3’-untranslated region，3’-UTR）结合来发挥作用。NDUFA4L2是本课题组在进行生物信息学分析时发现的与肾肿瘤形成相关的因子，与miR-183-5p具有靶向结合位点，但目前尚无研究报道二者在肾肿瘤中的表达特征。因此，本研究探讨了肾透明细胞癌中miR-183-5p和NDUFA4L2的表达特征，分析二者的关联性及其对预后的预测价值，从而为探讨肾肿瘤的形成提供依据。
1 材料与方法 1.1 研究对象收集2016年6月至2017年3月间在我院泌尿外科确诊为肾透明细胞癌并行根治性手术患者的临床资料。纳入标准：（1）首次发现肾透明细胞癌并行根治性手术，术后经病理诊断，符合世界卫生组织（World Health Organization，WHO）泌尿系统和男性生殖器官肿瘤标准；（2）临床资料完整。排除标准：（1）术前行放化疗者；（2）有严重的内科系统疾病、预期生存时间 < 60个月者。本研究共纳入57例患者，其中男30例，女27例；年龄40~82岁，平均年龄（60.4±9.2）岁；肿瘤最大径1.1~9.2 cm，平均（5.4±1.9）cm；WHO/国际泌尿病理学会（International Society of Urological Pathology，ISUP）分级：Ⅰ级5例，Ⅱ级21例，Ⅲ级22例，Ⅳ级9例；有脉管瘤栓10例，无脉管瘤栓47例；有神经累犯5例，无神经累犯52例；伴有坏死20例，无坏死37例。术后均留取肿瘤组织和距肿瘤边缘 > 2 cm的癌旁正常肾组织新鲜标本-80 ℃冰箱冻存，石蜡包埋组织标本。本研究获得我院医学伦理委员会批准。
1.2 材料人肾透明细胞癌786-0细胞株和人肾皮质近曲小管上皮HK-2细胞株，购自中国科学院上海细胞库；RPMI 1640培养基和胎牛血清，购自美国Gibco公司；TRIzol、NDUFA4L2（OTI5C10）浓缩液，购自美国赛默飞公司；免疫组化二抗和DAB，购自武汉博士德生物技术公司；RIPA裂解液和胰酶消化液，购自武汉三鹰生物公司。引物由苏州吉玛基因生物公司合成，应用美国Bio-Rad IQ5 PCR仪完成实验。
1.3 生物信息学分析采用基因表达谱数据动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）数据库（https://gepia.cancer-pku.cn）分析NDUFA4L2在肾透明细胞癌中的表达，重点分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库和基因型-组织表达数据库（Genotype-Tissue Expression，GTEx）来源的523例肿瘤和100例正常肾组织中NDUFA4L2表达。利用miRNA靶基因预测的生物信息学网站TargetScanHuman 7.2（https://www.targetscan.ort/vert_72）找出miR-183-5p的所有靶基因。将miR-183-5p所有靶基因输入注释、可视化和集成发现的数据库（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）6.8生物信息分析网站（https://david.ncifcrf.gro/home.jsp），进行综合生物学功能分析，应用基因本体论（gene ontology，GO）生物学功能富集分析以及京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路分析，筛选相关靶基因。将2组靶基因输入Venny2.1在线分析软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），取交集，找出关键的差异基因。
1.4 HE染色取石蜡包埋组织，切取4 μm切片，应用二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇脱蜡，自来水洗后置于蒸馏水中2 s，再置于苏木素中染色5 min，自来水洗后用1%盐酸乙醇分化，流水冲洗，碳酸锂饱和水溶液返蓝，流水冲洗，伊红染色5 s，自来水洗后置于75%乙醇中1 mim、95%乙醇中1 min、100%乙醇中20 s梯度脱水，再置于二甲苯中10 min，中性树胶封片。
1.5 免疫组织化学应用免疫组织化学EnVision法检测NDUFA4L2的表达。取石蜡包埋组织，切取4 μm胶片。应用不稀释浓度进行预实验，选择预实验中最理想显色的1∶500稀释浓度进行正式实验。NDUFA4L2表达阳性部位为细胞质。染色强度评分：无，0分；弱，1分；中，2分；强，3分。100倍镜下观察并选择热点区，选择3个200倍视野计算阳性评分：< 5%，0分；5%~ < 25%，1分；25%~ < 50%，2分；50%~ < 75%，3分；≥75%，4分。二者相乘为最终评分，总分为0~12分，≤5分为阴性，> 5分为阳性，计算NDUFA4L2的阳性率。
1.6 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）应用qRT-PCR检测miR-183-5p和NDUFA4L2 mRNA。TRIzol提取新鲜组织或细胞株中的总RNA，经Nano Drop2000微量紫外分光光度计检测浓度和纯度。引物序列：miR-183-5p，正向5’-TCGGCAGGCGTGTGTGACGCAACG-3’，反向5’-TCGGGTTAAGGTCGCCAACATAGAG-3’；NDUFA4L2 mRNA，正向5’-ACGTACGCGACGACGGTAGACGCAAC-3’，反向5’-TGACGTACGTGAACCCGGGTGACG-3’；U6为内参，正向5’-TCGTGATAGTGATGATCCAGCCA-3’，反向5’-CGTAGTAGTACAGATAGTAGATGA-3’。逆转录合成cDNA模板。反应体系：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s；95 ℃ 25 s，62 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，共35个循环。读取Ct值，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量，ΔΔCt = [Ct目的基因（未知样品）-Ct对照]-[Ct目的基因（校正样品）-Ct对照]。
1.7 统计学分析采用SPSS 24.0进行统计分析。计量资料用x±s表示，先行方差齐性检验或正态性检验，符合正态资料的2组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用Dunnett t检验。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。相关分析采用线性相关回归分析，生存分析采用Kaplan-Meier生存分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 生物信息学分析结果GEPIA数据库（图 1A）显示，肾透明细胞癌中NDUFA4L2表达可能升高。TargetScan数据库（图 1B）显示，miR-183-5p与NDUFA4L2 mRNA 3’-UTR可能具有结合位点（478~485）。
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| A, GEPIA database shows that NDUFA4L2 expression may be elevated in renal clear cell carcinoma; B, TargetScan database shows that miR-183-5p and NDUFA4L2 mRNA 3'-UTR may have binding sites (478-485). 图 1 生物信息学分析结果 Fig.1 Results of bioinformatic analysis |
2.2 病理结果
HE染色结果（图 2）显示，正常肾组织中可见肾小球、肾小管结构；肾透明细胞癌中肿瘤细胞呈巢状分布，肿瘤细胞透明，细胞核蓝染，部分区域可见核仁。
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| A, adjacent normal tissne; B, renal cancer tissue. 图 2 肾组织HE染色图像 Fig.2 Pathological images of renal tissues after HE staining |
2.3 miR-183-5p表达量和NDUFA4L2阳性率的比较
免疫组织化学染色结果（图 3）显示，NDUFA4L2在肾透明细胞癌中呈阳性表达，阳性表达定位于肿瘤细胞的细胞质，呈黄色或棕黄色，在癌旁正常肾组织中呈阴性表达。肾透明细胞癌的肿瘤组织中miR-183-5p表达量明显低于癌旁正常肾组织（P < 0.05），NDUFA4L2阳性率明显高于癌旁正常肾组织（P < 0.05）。见表 1。
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| A, adjacent normal tissne; B, renal cancer tissue. 图 3 肾组织免疫组织化学染色图像 Fig.3 Immunohistochemical staining of renal tissues |
| Group | n | Expression level of miR-183-5p | t | P | Expression of NDUFA4L2 [n（%）] | χ2 | P | |
| Positive | Negative | |||||||
| Renal cancer tissue | 57 | 1.21±0.26 | 7.42 | 0.000 1 | 34（59.65） | 23（40.35） | 21.32 | < 0.000 1 |
| Adjacent normal tissue | 57 | 1.95±0.34 | 10（17.54） | 47（82.46） | ||||
2.4 肾透明细胞癌的临床病理特征与miR-183-5p表达量、NDUFA4L2阳性率的关系
不同WHO/ISUP分级、有无肾窦累犯和不同肿瘤最大径间比较，miR-183-5p表达量、NDUFA4L2阳性率的差异有统计学意义（P < 0.05），而不同性别、不同年龄、有无神经累犯、有无脉管瘤栓、有无坏死间比较，miR-183-5p表达量、NDUFA4L2阳性率的差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
| Clinical pathological features | n | Expression level of miR-183-5p | t | P | Expression of NDUFA4L2 [n（%）] | χ2 | P | |
| Positive | Negative | |||||||
| Age | 0.76 | 0.654 5 | 1.290 2 | 0.256 0 | ||||
| < 60 years | 25 | 1.18±0.31 | 17（68.00） | 8（32.00） | ||||
| ≥60 years | 32 | 1.23±0.31 | 17（53.12） | 15（46.88） | ||||
| Sex | 0.87 | 0.468 5 | 0.234 1 | 0.628 5 | ||||
| Male | 30 | 1.25±0.24 | 17（56.67） | 13（43.33） | ||||
| Female | 27 | 1.17±0.33 | 17（62.96） | 10（37.04） | ||||
| WHO/ISUP level | 3.34 | 0.022 1 | 12.447 5 | 0.000 4 | ||||
| Ⅰ-Ⅱ | 26 | 1.52±0.32 | 9（34.62） | 17（65.38） | ||||
| Ⅲ-Ⅳ | 31 | 0.99±0.33 | 25（80.65） | 6（19.35） | ||||
| Vessel invasion | 1.01 | 0.299 6 | 0.000 6 | 0.980 1 | ||||
| No | 47 | 1.23±0.31 | 28（59.57） | 19（40.43） | ||||
| Yes | 10 | 1.14±0.24 | 6（60.00） | 4（40.00） | ||||
| Nerve invasion | 1.08 | 0.265 4 | 0.000 3 | 0.986 6 | ||||
| No | 52 | 1.23±0.22 | 31（59.62） | 21（40.38） | ||||
| Yes | 5 | 1.11±0.23 | 3（60.00） | 2（40.00） | ||||
| Renal sinus invasion | 3.08 | 0.015 4 | 5.301 7 | 0.021 3 | ||||
| No | 37 | 1.40±0.24 | 18（59.62） | 19（40.38） | ||||
| Yes | 20 | 0.85±0.13 | 16（60.00） | 4（40.00） | ||||
| Necrosis | 0.68 | 0.675 0 | 1.191 9 | 0.275 0 | ||||
| No | 37 | 1.23±0.22 | 24（64.86） | 13（35.14） | ||||
| Yes | 20 | 1.17±0.27 | 10（50.00） | 10（50.00） | ||||
| Maximum tumor diameter | 4.55 | 0.009 1 | 15.368 5 | < 0.000 1 | ||||
| < 5 cm | 20 | 1.63±0.31 | 5（25.00） | 15（75.00） | ||||
| ≥5 cm | 37 | 0.98±0.22 | 29（78.38） | 8（21.62） | ||||
2.5 肾透明细胞癌中miR-183-5p表达量与NDUFA4L2评分的相关性分析
线性相关回归分析结果显示，miR-183-5p表达量和NDUFA4L2评分呈负相关（F = 21.89，P < 0.000 1）。见图 4。
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| 图 4 肾透明细胞癌中miR-183-5p表达量与NDUFA4L2评分的相关性 Fig.4 Correlation between the expression level of miR-183-5p and NDUFA4L2 score in renal clear cell carcinoma |
2.6 miR-183-5p表达量和NDUFA4L2评分的生存分析
患者术后随访截止时间点为2022年3月31日，术后生存时间为12~60个月，中位生存时间为43个月。生存分析显示，miR-183-5p的表达量（临界值为1.21，χ2=4.32，P = 0.026）和NDUFA4L2评分（临界值为5分，χ2=3.76，P = 0.035）均与术后生存时间相关。
2.7 786-0和HK-2细胞株中miR-183-5p和NDUFA4L2 mRNA表达的比较786-0和HK-2细胞株中，miR-183-5p表达量分别为1.24±0.35和1.88±0.29，786-0细胞株明显低于HK-2细胞株（t = 4.87，P = 0.032 2），NDUFA4L2 mRNA表达量分别为2.23±0.47和1.23±0.32，786-0细胞株明显高于HK-2细胞株（t = 5.64，P = 0.005 1）。
3 讨论肾透明细胞癌病变形成与基因和遗传因素有关，肿瘤形成过程中常伴有缺氧，NDUFA4L2是低氧代谢适应的元素，当缺氧到中等程度时能下调线粒体复合物Ⅰ。研究[1]显示，NDUFA4L2下调后能增加线粒体活性氧的产生。NDUFA4L2能调节缺氧时的耗氧量、细胞膜电位和活性氧的形成。研究[2]显示，NDUFA4L2是ETC复合体Ⅰ亚基的组成部分，与PDK协同抑制线粒体Ⅰ复合体在乏氧微环境中的细胞活性。有学者在肝癌组织中观察到NDUFA4L2 mRNA过表达，并通过划痕实验证实了NDUFA4L2对细胞侵袭的促进作用[3]。还有学者在胶质瘤中发现NDUFA4L2过表达可以促进肿瘤细胞的增殖和侵袭，认为其能作为预后指标[4]。
本课题组通过生物信息学分析发现miR-183-5p与肾肿瘤形成可能相关，且与NDUFA4L2具有结合位点。研究[5]显示，miR-183-5p异常表达可能是肾肿瘤发生、发展时调控轴的重要一环。相继有研究在肺癌[6]、宫颈癌[7]等恶性肿瘤中发现了miR-183-5p的异常表达，并发现了miR-183-5p调控的重要下游靶分子。
本研究结果显示，肾透明细胞癌中miR-183-5p的表达明显下调，NDUFA4L2的表达明显升高，提示miR-183-5p低表达、NDUFA4L2高表达是肿瘤形成中的重要分子事件。本研究通过细胞实验进行进一步验证，结果显示，miR-183-5p和NDUFA4L2的表达与肿瘤最大径相关，从而提示miR-183-5p和NDUFA4L2异常表达是促进肿瘤生长的重要因素。本研究结果还显示，二者异常表达与肾窦累犯相关，提示miR-183-5p和NDUFA4L2异常表达是促进肿瘤细胞侵袭的重要因素。肿瘤细胞由于生长繁殖速度过快，而血管的生成较慢，使肿瘤细胞处于乏氧状态[8]。NDFA4L2作为呼吸电子传送链复合物Ⅰ亚基的成分，在乏氧环境中介导复合体Ⅰ的活性，可以将电子从NADH转到非共价结合的黄素单核苷酸中，此过程可以伴有大量活性氧和细胞增殖因子的产生[9-10]。这也是氧化还原的重要途径，对促进NDUFA4L2的活化起明显作用，此过程伴随着肿瘤细胞增殖，细胞分裂活跃，肿瘤生长迅速，侵袭性增强。也有研究[11]认为NDUFA4L2可提高其下游糖酵解酶基因的表达，影响肿瘤的失控性增殖和能量代谢。NDUFA4L2具有阻滞干细胞分化的特征，使肿瘤细胞趋于幼稚，并具有多向分化潜能和明显的恶性转化现象。
本研究证实了miR-183-5p和NDUFA4L2具有负向协同作用，间接证实了生物信息学发现的二者可能具有结合位点。miR-183-5p可能是NDUFA4L2上游调控因子，共同调控肿瘤细胞的侵袭和增殖[12-13]，这也是miRNA的经典作用方式。后续研究需要进行细胞实验，应用双荧光素酶报告基因实验进一步验证。miR-183-5p调控后NDUFA4L2的功能可能增强，包括促进血管内皮生长因子的生成等，使肿瘤间质的血管内皮细胞增生，构建新的血管，使肿瘤细胞的氧供增加，促进肿瘤细胞增殖。本研究结果显示，miR-183-5p和NDUFA4L2的表达均与术后生存时间相关，提示miR-183-5p和NDUFA4L2对判断患者预后有重要价值，即miR-183-5p低表达、NDUFA4L2高表达的患者术后生存时间短、预后差。由于NDUFA4L2可能是肾肿瘤调控网络中的重要一环，miR-183-5p在肿瘤中调控作用可能涉及其他多种下游因子[14]。因此，后续研究中进行细胞因子网络的筛选可能对阐明肿瘤形成有更大价值。后续研究应纳入更多样本，并进行多中心研究。
综上所述，本研究结果显示，肾透明细胞癌中miR-183-5p低表达、NDUFA4L2高表达，二者呈负相关，对肿瘤病变的形成和进展具有促进作用，检测二者的表达可能对预后有预测价值。
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