2023, Vol. 52文章信息
- 于冬冬
- YU Dongdong
- 藁本内酯对骨肉瘤细胞凋亡的影响及其作用机制
- Effect of ligustilide on osteosarcoma cell apoptosis and its mechanism of action
- 中国医科大学学报, 2023, 52(4): 301-307
- Journal of China Medical University, 2023, 52(4): 301-307
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文章历史
- 收稿日期：2022-06-23
- 网络出版时间：2023-04-12 14:00:24
引用本文 |
骨肉瘤是常见的原发性骨恶性肿瘤，治疗方法主要是新辅助化疗[1]。顺铂是骨肉瘤化疗常用药物，研究[2]发现细胞能够通过自噬这种生物学行为对顺铂产生抗凋亡的作用，因此抑制自噬能够促进细胞凋亡，提高顺铂的化疗效果。藁本内酯属于苯酞类化合物，是从当归、川芎等伞形科草本植物中萃取出的一种生物活性成分，具有抗炎、抗肿瘤等作用[3]。目前，藁本内酯对骨肉瘤的生物学作用还不清楚。本研究探讨藁本内酯对骨肉瘤细胞凋亡的影响及其作用机制，旨在为骨肉瘤的治疗提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 实验药品、试剂与仪器藁本内酯（成都植标化纯生物有限公司），顺铂（北京索莱宝科技有限公司），胎牛血清（康源绿洲生物有限公司），CCK8试剂（德国Sigma公司），细胞周期检测试剂盒（美国Santa Cruz Biotechnology公司），Bcl-2抗体和Bax抗体（Santa Cruz Biotechnology公司），细胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）抗体、Beclin 1抗体（美国Proteintech公司），LC3B抗体、自噬蛋白（autophagy related protein，ATG）3抗体（美国Cell Signaling Technology公司），羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（北京中衫金桥生物技术有限公司），ULK1抗体（中国博士德生物公司），酶标仪（德国Sigma公司），流式细胞仪（美国BD公司）。
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养人骨肉瘤MG-63细胞购于中科院上海细胞库。骨肉瘤细胞使用含有10%胎牛血清，1%青链霉素双抗的培养基置于37 ℃恒温培养箱中培养。
1.2.2 细胞毒性实验将处于对数生长期的骨肉瘤细胞5×103/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后用20、40、80、160、320、640 μmol/L藁本内酯处理细胞24、48 h，以1‰甲醇处理MG-63作为对照组，加入CCK8试剂采用酶标仪测定，绘制抑制率曲线。选取浓度80、160、320 μmol/L藁本内酯与顺铂（0、2、4、8、16 μg/mL）联合使用24 h，测定联合用药的最佳浓度。
1.2.3 细胞划痕实验将处于对数生长期的骨肉瘤细胞1×104/孔接种于6孔板，待细胞贴壁后用10 μL的枪头进行划痕，PBS清洗，实验组加入含有藁本内酯（160 μmol/L）的培养基（3 mL），以1‰甲醇处理对照组，放入恒温培养箱培养。培养0、24、48 h时取样并照相。
1.2.4 流式细胞周期实验骨肉瘤细胞MG-63清洗、消化、离心、重新混悬后以5×103/孔均匀铺在6孔板中，分别采用浓度0、40、80、160、320 μmol/L藁本内酯（3 mL）处理24 h，以1‰甲醇处理MG-63作为对照组。将各组细胞清洗、消化、离心，固定后加入细胞凋亡试剂盒中的PI/RNase混匀，4 ℃条件下孵育30 min后流式细胞仪进行检测。
1.2.5 Western blotting检测骨肉瘤MG-63细胞经过消化离心后以5×103/孔均匀铺在6孔板上。将细胞分为对照组（1‰甲醇处理MG-63）、顺铂（16 μg/mL，DDP）组、藁本内酯联合顺铂（16 μg/mL顺铂+160 μmol/L藁本内酯，DDP+LIG）组、顺铂+3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3MA）（16 μg/mL顺铂+6 mmol/L 3MA，DDP+3MA）组。各组药物处理24 h后进行蛋白质提取、测定蛋白浓度、电泳、转膜、加入一抗、TBST清洗、加二抗、孵育，以GAPDH为内参，ECL显色成像获取蛋白条带，Image J软件分析蛋白条带灰度值。
1.2.6 免疫荧光实验将骨肉瘤MG-63细胞消化离心后以5×103/孔均匀铺在6孔板上，细胞贴壁后分别用顺铂（16 μg/mL）、顺铂（16 μg/mL）+藁本内酯（160 μmol/L）、顺铂（16 μg/mL）+3MA（6 mmol/L）处理细胞24 h，以1‰甲醇处理细胞作为对照组。冰PBS漂洗5 min，清洗3次，4%预冷处理的多聚甲醛固定MG-63细胞20 min，0.1%Triton X-100破膜10 min，加入0.75% H2O2-PBS孵育30 min，滴加适量PBS稀释一抗，然后放入4 ℃冰箱过夜，次日PBS适当稀释和二抗孵育30 min，加入适量PBS稀释免疫荧光试剂，封片，荧光显微镜采集图片。
1.3 统计学分析利用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 细胞毒性实验结果不同浓度（20、40、80、160、320、640 μmol/L）藁本内酯处理骨肉瘤细胞24 h、48 h的结果显示，随着藁本内酯浓度升高，骨肉瘤细胞抑制率明显增加（P < 0.01），见表 1。不同浓度（0、2、4、8、16 μg/mL）顺铂联合藁本内酯（80、160、320 μmol/L）处理骨肉瘤细胞24 h的结果显示，随着顺铂和藁本内酯浓度增高，骨肉瘤细胞抑制率明显增高（P < 0.01），见表 2。16 μg/mL顺铂联合160 μmol/L藁本内酯干预骨肉瘤细胞24 h，细胞抑制率接近半数，因此选用此浓度联合用药用于后续实验。
| Group | Proliferation inhibit rate of osteosarcoma cells | |
| 24 h | 48 h | |
| 0 μmol/L ligustilide | 2±1 | 2±1 |
| 20 μmol/L ligustilide | 2±1 | 2±1 |
| 40 μmol/L ligustilide | 4±1 | 7±1 |
| 80 μmol/L ligustilide | 9±1 | 15±11） |
| 160 μmol/L ligustilide | 15±21） | 40±42） |
| 320 μmol/L ligustilide | 39±42） | 63±42） |
| 640 μmol/L ligustilide | 71±22） | 85±42） |
| 1）P < 0.05，2）P < 0.01 compared with 0 μmol/L ligustilide group. | ||
| Group | Proliferation inhibit rate of osteosarcoma cells | ||
| 80 μmol/L ligustilide | 160 μmol/L ligustilide | 320 μmol/L ligustilide | |
| 0 μg/mL cisplatin | 9±1 | 15±2 | 39±4 |
| 2 μg/mL cisplatin | 10±1 | 29±2 | 61±31） |
| 4 μg/mL cisplatin | 15±1 | 33±3 | 64±31） |
| 8 μg/mL cisplatin | 31±32） | 36±32） | 67±41） |
| 16 μg/mL cisplatin | 46±51） | 48±21） | 77±61） |
| 1）P < 0.01，2）P < 0.05 compared with 0 μg/mL cisplatin group in the same concentration ligustilide. | |||
2.2 细胞划痕实验结果
细胞划痕实验结果显示，与对照组比较，藁本内酯（160 μmol/L）作用24 h、48 h时骨肉瘤细胞迁移速率明显降低（P < 0.05），见图 1、表 3。
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| 图 1 藁本内酯对骨肉瘤细胞迁移的影响×10 Fig.1 Effect of ligustilide on osteosarcoma cell migration ×10 |
| Group | Migration of osteosarcoma cells | ||
| 0 h | 24 h | 48 h | |
| Control | 0±0.00 | 63.70±6.53 | 97.30±0.82 |
| Ligustilide | 0±0.00 | 10.30±1.321） | 15.93±2.951） |
| 1）P < 0.05 compared with the control group at the same time. | |||
2.3 流式细胞仪检测结果
流式细胞仪检测结果显示，随着藁本内酯浓度增加，G2/M期骨肉瘤细胞比例显著增加（均P < 0.01），G0/G1期骨肉瘤细胞比例下降（均P < 0.01），说明藁本内酯将骨肉瘤细胞周期阻滞在了G2/M期，见图 2。
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| *P < 0.01, #P < 0.05 vs 0 μmol/L ligustilide group. 图 2 流式细胞仪检测结果 Fig.2 Flow cytometry results |
2.4 Western blotting检测结果
结果显示，与对照组比较，DDP组Cyt-C表达增高（P < 0.01），促凋亡蛋白Bax表达增高（P < 0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低（P < 0.01）。与DDP组比较，DDP+LIG组Bax表达增高（P < 0.01），Bcl-2表达降低（P < 0.01），Cyt-C表达增高（P < 0.01），说明DDP+LIG组骨肉瘤细胞凋亡更显著。与DDP组比较，DDP+3MA组抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低（P < 0.01），促凋亡蛋白Bax表达增高（P < 0.05），见图 3。
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| ** P < 0.01 compared with the control group; ΔΔ P < 0.01, ## P < 0.05 compared with the DDP group. 图 3 藁本内酯联合顺铂对骨肉瘤细胞凋亡的影响 Fig.3 Effect of ligustilide combined with cisplatin on osteosarcoma cell apoptosis |
自噬蛋白检测结果如图 4所示，与对照组比较，DDP组自噬蛋白LC3B、Beclin 1表达增高（均P < 0.05），说明顺铂能够促进骨肉瘤细胞自噬。与DDP组比较，DDP+LIG组自噬蛋白LC3B、Beclin 1表达降低（均P < 0.05），说明藁本内酯起到了抑制骨肉瘤细胞自噬的作用。与对照组比较，DDP组ULK1、ATG3表达增加（均P < 0.01），说明该通路被激活。与DDP组比较，DDP+LIG组ULK1、ATG3表达均降低（均P < 0.05），说明藁本内酯有抑制ULK1、ATG3信号通路的作用。与DDP组比较，DDP+3MA组ULK1、ATG3表达均降低（均P < 0.05），说明藁本内酯抑制自噬的作用机制可能是通过ULK1、ATG3信号通路实现的。
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| ** P < 0.01 compared with the control group; ΔΔ P < 0.01, Δ P < 0.05 compared with the DDP group. 图 4 藁本内酯联合顺铂对骨肉瘤细胞自噬的影响 Fig.4 Effect of ligustilide combined with cisplatin on osteosarcoma cell autophagy |
2.5 免疫荧光实验结果
结果显示，DDP组发光自噬体（标记的LC3B）数量较对照组增多，说明DDP组诱导骨肉瘤细胞发生了自噬。DDP+LIG组发光自噬体数量少于DDP组，说明藁本内酯能够降低细胞自噬。DDP+3MA组与DDP+LIG组发光自噬体数量都较DDP组少，说明藁本内酯起到了与自噬抑制剂3MA相同的抑制自噬作用，见图 5。
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| A, control group; B, DDP group; C, DDP+LIG group; D, DDP+3M group. 图 5 各组免疫荧光实验LC3B表达的检测结果×200 Fig.5 LC3B expression in the four treatment groups detected by immunofluorescence assay ×200 |
3 讨论
顺铂是骨肉瘤常用化疗药物，但容易产生耐药性，这成为骨肉瘤治疗的障碍[4]。近年来，中药提取物与化疗药物结合的方式受到普遍关注。藁本内酯是从伞形科植物当归中提取出来的一种淡黄色油性物质。藁本内酯很不稳定，容易发生氧化、水解等异构化反应。研究[5-7]显示藁本内酯作用广泛，具有抗动脉粥样硬化、抗老年痴呆、改善脑部供血等多种药理学作用。研究[8]发现，骨肉瘤增殖过程中细胞周期进程加速，促进了骨肉瘤的增殖和转移。也有研究[9-10]发现骨肉瘤中miRNA-506-3p表达降低，导致CDK4表达增加，促进了骨肉瘤增殖；此外，细胞周期蛋白（cyclinD1）过度表达可缩短细胞G1期到S期的过程，促使细胞更快完成DNA复制[11]。因此，调控细胞周期蛋白也是治疗骨肉瘤的潜在靶点。本研究结果显示，藁本内酯能够抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移，将骨肉瘤细胞周期阻滞在G2/M期，因此认为可能是通过阻滞细胞周期来抑制骨肉瘤的进展。
Bcl-2是内线粒体膜蛋白，可阻断程序性细胞死亡[12]。Bax是骨肉瘤中常见的促凋亡蛋白[13]。Cyt-C是线粒体损伤的标志物[14]，释放到细胞质基质中会触发半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3裂解以诱导细胞凋亡[15]。本研究结果显示，与DDP组比较，DDP+LIG组Cyt-C和Bax表达增高，Bcl-2表达降低（均P < 0.05），骨肉瘤细胞凋亡更显著，说明藁本内酯能够协助顺铂发挥更大的促进骨肉瘤细胞凋亡的作用。
Beclin 1是自噬启动因子，Beclin 1激活能够诱导自噬发生[16]。LC3是自噬过程中第1个自噬小体膜蛋白，也是自噬过程中产生的典型标志物，LC3经过蛋白内切酶的剪切形成膜结合形式的LC3B，LC3B表达与自噬呈正相关[17-18]。与DDP组比较，DDP+LIG组自噬蛋白LC3B、Beclin 1表达降低，同时免疫荧光结果显示DDP+LIG组中被标记的LC3B荧光体数量也减少，说明藁本内酯起到了抑制骨肉瘤细胞自噬的作用。
ULK1是负责自噬启动部分的调控因子[19]，与其他ATG101等相关自噬蛋白结合形成多数自噬必需的ULK复合体。以往研究[20]发现ULK1参与调控的自噬信号通路与乳腺癌、肝癌高度相关。ATG基因是形成自噬体的重要组成部分，ATG3是参与自噬的关键基因之一，其同源物在真核生物中常见。有研究[21]发现ATG3是自噬发挥抗肿瘤作用的重要信号通路。本研究结果显示，与DDP组比较，DDP+LIG组ULK1、ATG3表达降低（均P < 0.05），说明藁本内酯能够抑制此自噬通路，可能的机制是通过抑制ULK1/ATG3信号通路来完成的。
综上所述，藁本内酯能够抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移，阻滞细胞周期，促进细胞凋亡。藁本内酯联合顺铂能够抑制自噬来促进细胞凋亡，其作用机制可能是通过抑制ULK1/ATG3信号通路实现的。本研究集中于藁本内酯对骨肉瘤细胞抑制增殖或促进凋亡方面，方向较为单一，且目前仅用单味中药治疗骨肉瘤很难取得明显疗效，未来还需进一步研究论证。
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