胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，在世界范围内其发病率和致死率在所有癌症中分别居第5位和第4位。我国每年新发病例和死亡病例约占全球40%以上^[1]。由于早期隐匿性较强，大多数胃癌患者就诊时已为晚期，并常伴有侵袭或转移，预后较差。因此，明确胃癌发生、发展的机制，寻找早期诊断、预后评估的分子标志物具有重要意义。人类基因组中95%以上基因会发生可变剪接，可变剪接是基因表达在转录后水平上的重要调控机制。富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子SR蛋白家族（serine/arginine-rich proteins，SRSF）在RNA可变剪接过程中发挥重要调控作用，通过识别并结合前体RNA上的剪接元件，招募组装剪接体从而促进或抑制可变剪接事件的发生。近年来，多种肿瘤组织中均发现SRSF异常表达，通过引起肿瘤相关基因的可变剪接失调介导肿瘤细胞多种生物学行为^[2-3]，在肿瘤形成演进过程中发挥“闸门”的作用，为肿瘤治疗开辟新的方向。SRSF11是SR蛋白家族成员之一，具有经典的SR蛋白结构域，目前发现其可参与多个基因的可变剪接调控，但有关SRSF11在肿瘤发展中作用的研究鲜有报道。本研究基于生物信息学分析SRSF11在胃癌中的表达情况及其与临床病理特征、预后的关系，并探讨其相关机制，旨在为胃癌早期诊断、预后评估以及治疗策略提供新的靶点。

1 材料与方法 1.1 数据来源

1.1.1 癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库

从TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载胃癌患者的转录组数据和临床信息。从GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载胃癌组织转录组芯片数据集。

1.1.2 TIMER 2.0数据库

利用TIMER 2.0（http://timer.cistrome.org/）数据库中的“Cancer Exploration”模块分析SRSF11在TCGA数据库各肿瘤组织和癌旁正常组织中的表达情况；利用“Immune Association”模块分析SRSF11表达与肿瘤免疫细胞浸润的关系及其对患者预后的影响。

1.1.3 UALCAN数据库

利用UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu）分析SRSF11表达与患者临床病理特征（年龄、组织学分级、临床分期、淋巴结转移和TP53突变）的关系。

1.1.4 Kaplan-Meier plotter数据库

利用Kaplan-Meier plotter数据库（https://kmplot.com/analysis/）分析SRSF11表达与胃癌患者预后的关系；并基于患者临床病理特征进行分层分析。

1.1.5 TCGA spliceseq数据库：利用TCGA spliceseq

（http://bioinformatics.mdanderson.org/TCGASpliceSeq/）下载与TCGA胃癌样本相对应的剪接百分比（percent-spliced in，PSI）矩阵，将有效值> 90%且PSI标准差 > 0.1的事件纳入后续研究。根据RNA-seq数据中SRSF11表达水平，选取40例胃癌样本分成高表达组和低表达组，分别计算可变剪接PSI值，以|ΔPSI|≥0.2筛选差异可变剪接事件。

1.1.6 MetaScape数据库

利用MetaScape数据库（http://metascape.org/）对SRSF11相关可变剪接事件涉及的基因进行基因本体论（Gene Ontology，GO）功能注释以及京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.2 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0进行统计学分析。肿瘤组织和配对癌旁正常组织间的表达差异采用配对样本t检验；两组间的差异分析采用独立样本t检验。采用Kapalan-Meier法估计生存率并绘成生存曲线，log-rank检验进行生存率差异分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 不同肿瘤中SRSF11的表达情况

应用TIMER数据库分析TCGA不同肿瘤中SRSF11的表达情况，结果显示SRSF11在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、胆管癌、结肠癌、食管癌、头颈鳞状细胞癌、肝细胞肝癌、肺腺癌、肺鳞癌、胃癌和子宫内膜癌组织中的表达均明显高于正常组织（P < 0.001）；但在肾嫌色细胞癌和甲状腺癌中的表达则低于正常组织（P < 0.001），见图 1。

2.2 胃癌中SRSF11的表达情况

利用TCGA和GEO数据集（GSE33335、GSE63089、GSE13861和GSE54129）进一步验证胃癌中SRSF11的表达，与配对和非配对正常组织比较，胃癌组织中SRSF11的表达均明显上调，差异有统计学意义（均P < 0.05），见图 2。

2.3 SRSF11表达与临床病理特征的关系

UALCAN在线工具分析结果显示，与N₀期比较，SRSF11表达在N₁、N₂期呈上升趋势；与非突变组比较，SRSF11在TP53基因突变组的表达显著增高（P < 0.01）。但SRSF11表达与患者年龄、临床分期、组织学分级均无明显相关性（均P > 0.05），见图 3。

2.4 胃癌中SRSF11表达对患者预后的影响（图 4）

Kaplan-Meier生存分析结果显示，SRSF11表达水平对胃癌患者总生存期（overall survival，OS）、首次进展生存期（first-progression survival，FP）和进展后生存率（post progression survival，PPS）有显著影响，低表达组患者的OS、FP和PPS均明显高于高表达组（P < 0.001，图 4A~4C）。基于临床病理特征进行分层分析结果显示，不同性别、临床分期2~3期、T2-3期、N各期和Lauren分型患者中，SRSF11表达增高均与患者预后不良相关（均P < 0.05）；在N₁~N₃期，随着淋巴结转移数增加，SRSF11导致胃癌死亡的风险比（hazard ratio，HR）逐渐升高，见图 4D。

2.5 SRSF11表达与免疫浸润的关系

利用TIMER数据库评估SRSF11表达与肿瘤微环境中不同免疫细胞浸润的关系，结果如图 5A所示，SRSF11表达与B细胞、CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞浸润呈正相关（均P < 0.05）；而与巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞浸润呈负相关（均P < 0.05）。评估免疫细胞浸润、基因表达与临床预后的关系发现，在SRSF11低表达组，高水平CD4⁺T细胞浸润提示胃癌患者预后较好（P < 0.05，图 5B）；而巨噬细胞高浸润量则与患者预后不良相关（P < 0.05，图 5C）。

2.6 SRSF11调控的可变剪接事件和基因

提取SpliceSeq的初始矩阵，排除有效值占比 < 80%的样本（7例），共获得445例样本（胃癌组织409例，癌旁正常组织36例）和8 661个剪接事件。分别计算SRSF11高表达组和低表达组（图 6A）的PSI值，按|ΔPSI|≥0.2筛选差异可变剪接事件，共得到1 182个差异可变剪接事件和839个差异剪接基因（图 6B）。其中促进剪接事件843个（71.3%），抑制剪接事件339个（28.7%），以可变启动子（alternate promoter，AP）、内含子保留（retained intron，RI）和外显子跳跃（exon skipping，ES）最常见，可变终止子（alternate terminator，AT）、可变3’端（alternate acceptor sites，AA）和可变5’端（alternate donor sites，AD）相对较少，互斥外显子（mutually exclusive exons，ME）事件最少。

对SRSF11相关的差异剪接基因进行GO功能注释和KEGG富集分析，发现其生物学过程（biological process，BP）主要涉及蛋白分解代谢、RNA剪接、DNA结合、自噬和囊泡转运等；细胞组成（cellular component，CC）主要分布在核被膜、中心体和核斑点等；分子功能（molecular function，MF）主要调节ATP依赖性活性、分子适配活性和激酶活性等（图 6C）。KEGG富集分析显示主要参与病毒感染、溶酶体、三磷酸腺苷结合盒（ATP binding cassette，ABC）转运体、核转录因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信号通路、低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号通路和DNA修复等（图 6D）。

3 讨论

可变剪接是调控基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制，已成为功能基因组学的研究重点。与正常组织比较，癌组织中广泛存在基因可变剪接失调，这些异常剪接事件与肿瘤增殖、侵袭和转移等多种生物学行为有关；一些肿瘤相关基因的可变剪接产物发挥着不同的功能，直接影响着肿瘤的进展和治疗，有望成为肿瘤新的生物标志物和治疗靶标^[4-5]。

SRSF是一类进化十分保守的剪接因子家族，在人类细胞中包括12个家族成员（SRSF1~SRSF12）。SR蛋白通过参与前体mRNA组成性剪接和可变剪接、mRNA出核、稳定性以及翻译等多个过程，在基因表达调控中发挥重要作用^[2]。近年来，SR蛋白家族的很多成员被发现在多种肿瘤中存在异常表达。WAN等^[6]发现SRSF6可引起紧密连接蛋白ZO-1剪接异常促进结直肠癌的进展；肾上腺素β2受体激动剂茚达特罗通过抑制SRSF6功能发挥抗肿瘤作用。SRSF9通过靶向caspase-2产生2种功能截然相反的剪接异构体调控细胞凋亡^[7]。SRSF12被发现在肝癌组织和细胞中表达下调，可能发挥抑癌基因的功能^[8]。端粒酶是肿瘤细胞持续增殖所必需的，LEE等^[9]研究发现SRSF11作为一种核斑点靶向因子，通过与端粒酶RNA组分和端粒结合蛋白TRF2的相互作用调节端粒酶与端粒的关联，为改变肿瘤中端粒酶活性提供潜在靶点。SRSF11作为外显子10剪接阻遏子调控Tau基因的可变剪接^[10]。最近研究^[11]发现SRSF11缺乏通过引起LRP8和ApoE基因的可变剪接异常，导致JNK信号通路失活，调控衰老进程。

本研究通过对TCGA、GEO中多个数据集分析，发现SRSF11在胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，并且其表达与淋巴结转移及TP53基因突变有关。通过Kaplan-Meier法分析发现SRSF11高表达与胃癌患者预后不良显著相关。淋巴结转移是胃癌最常见的转移类型，与患者预后直接相关。基于临床病理特征的分层分析显示，SRSF11表达增高在淋巴结转移各期均导致患者预后较差；且随着淋巴结转移数的增加，胃癌特异性死亡的风险比逐渐升高，提示SRSF11可能通过促进淋巴结转移影响患者预后。这些结果表明SRSF11在一定程度上可能作为致癌基因促进胃癌的发生、发展，其表达水平可能是评估患者预后的潜在指标。

肿瘤微环境中免疫细胞的浸润，不仅影响着肿瘤进展和预后，还影响肿瘤对治疗的反应，浸润的免疫细胞可能作为药物靶标来改善患者预后^[12]。淋巴细胞浸润是胃癌患者淋巴结转移和预后的独立预测因素^[13]。有些淋巴细胞促进肿瘤的发展，而另一些淋巴细胞则抑制肿瘤发展，并且在肿瘤不同时期可能发挥不同的作用。CD8⁺T细胞是肿瘤免疫的主要效应细胞，对抗肿瘤反应和患者预后产生重要影响，但CD8⁺T细胞浸润水平与患者预后之间的关系仍存在争议。WANG等^[14]发现胃癌中CXCR5⁺CD8⁺T细胞高浸润患者具有更长的整体生存时间，并对术后辅助化疗或联合放疗有更好的响应。但YUAN等^[15]发现分泌IL-17的CD8⁺T细胞比例增高可促进胃癌进展并与患者预后不良相关。本研究中SRSF11的表达与胃癌中整体CD8⁺T细胞的浸润水平呈正相关，但具体影响可能还与其空间分布及各亚型功能表型特征有关。作为肿瘤间质中的主要浸润细胞，巨噬细胞在胃癌等多种肿瘤的进展和侵袭中起重要作用，与其预后不良相关^[16]。本研究发现巨噬细胞浸润量和SRSF11表达为胃癌患者临床预后的风险因素，且巨噬细胞浸润量还与SRSF11表达相关，但两者间确切关系仍有待进一步明确。

SR蛋白是基因可变剪接的重要调控因子，当其在肿瘤中异常表达时，则可能导致肿瘤相关基因的可变剪接发生紊乱，促进肿瘤发生。本研究从SRSF11调控的可变剪接基因出发，探究SRSF11发挥促癌功能的分子机制。通过分析胃癌中不同表达水平的SRSF11引起的转录本可变剪接事件改变筛选差异可变剪接事件，发现SRSF11可以通过不同的方式调控下游剪接事件的发生，既可以促进外显子剪接，同时也能抑制部分外显子的剪接；其调控的剪接形式以AP最常见，其次是RI和ES。KEGG通路分析显示SRSF11靶基因主要富集于单纯疱疹病毒1（herpes simplex virus 1，HSV-1）和耶尔森菌感染通路。HSV-1具有杀伤肿瘤细胞和诱导抗肿瘤免疫反应的双重潜力，在胃癌等多种肿瘤的治疗中展现了良好的应用前景^[17]。由耶尔森菌引起的感染，主要累及胃肠道，可表现为急性胃肠炎、小肠结肠炎和败血症等。此外，SRSF11靶基因也参与ABC转运体、NF-κB和HIF-1等肿瘤相关信号通路，这可能与SRSF11调控胃癌细胞增殖、侵袭、转移和多药耐药等有关。

综上所述，本研究通过生物信息学分析发现剪接因子SRSF11在胃癌组织中的表达显著上调，且与患者的不良预后相关；SRSF11表达可影响肿瘤微环境中免疫细胞的浸润。SRSF11可能作为潜在的致癌基因参与胃癌的发生、发展。但本研究仅通过多个数据库挖掘，在基因转录水平上分析了SRSF11在胃癌中潜在的临床意义及可能的机制，后续须进一步在组织、细胞和动物水平上进行表达和功能验证，以明确SRSF11能否作为胃癌诊断、预后标志物和治疗靶点。