食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，2020年数据显示全球食管癌发病和死亡病例数量分别位于恶行肿瘤发病和死亡顺位的第7位和第6位^[1]。在全世界的食管癌患者中，我国患者约占50%^[2]。食管癌早期症状轻微，晚期可转移至肝脏、肺、骨、胸膜等。虽然大量研究机构对食管癌的发病进行了研究，但其发病机制仍不明确。

FAM189A2基因位于9号染色体长臂（9q21.12），基因全长2 559 bp，编码450个氨基酸。1994年，DUCLOS等^[3]应用外显子诱捕法首次在9号染色体的Friedreich共济失调区分离获得。FAM189A2主要分子生物学功能为参与蛋白质结合、泛素连接酶激活剂活性、参与信号通路负向调节，其作为E3泛素蛋白连接酶ITCH的激活因子，参与CXCL12激活的CXCR4受体泛素化，负调控CXCL12/CXCR4信号通路，与乳腺癌发生发展相关^[4-5]。目前FAM189A2在食管癌中鲜有研究，其作用机制尚不明确。本研究通过生物信息学数据库挖掘，并结合基础实验，分析FAM189A2在食管癌中的表达水平及对疾病预后的影响，为进一步研究FAM189A2在食管癌中的作用机制和治疗方案提供理论依据与思路。

1 材料与方法 1.1 UALCAN数据库FAM189A2的信息检索与表达差异分析

应用UALCAN数据库，分析FAM189A2在多种肿瘤中的表达状态，及其在食管癌中和正常食管组织中的表达水平以及与年龄、性别、分期、病理、体质量、TP53突变的关系，并探索FAM189A2表达与基因甲基化水平的关系。筛选条件为：（1）进入UALCAN网站，Enter gene symbol（s）：FAM189A2；（2）TCGA datasheet：Esophageal cancer；（3）Explore：Pan-cancer view；（4）Explore：Experssion；（5）Methylation Analysis。

1.2 FAM189A2 mRNA表达验证实验

收集天津医科大学总医院心胸外科标本库冻存的15例食管鳞状细胞癌患者手术切除的肿瘤组织和癌旁组织，应用TRIzol试剂盒提取组织的RNA，逆转录为cDNA，应用实时定量PCR仪器进行基因相对定量检测。FAM189A2上游引物：5’-TCTGGTGGACTTAGGTGAA-3’，下游引物：5’-TTGCGAATATCTGGAGGTAG-3’；GAPDH上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物：5’-GGGTGGAATCATATTGGAAC -3’。扩增条件为95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。应用2^-ΔΔCt法计算FAM189A2在肿瘤组织和正常组织中的相对表达水平。

1.3 GEPIA数据库FAM189A2的信息检索与预后分析

应用GEPIA数据库，分析FAM189A2的表达与预后的关系。筛选条件为：（1）Gene name：FAM189A2；（2）Methods：Overall Survival；（3）Group Cutoff：Median；（4）Hazards Ratio：Yes；（5）95%Confidence Interval：No；（6）Axis Units：Months；（7）Datasets Selection：ESCA。

1.4 STRING数据库分析FAM189A2相互作用蛋白

应用STRING数据库，分析FAM189A2相互作用蛋白。筛选条件为：（1）Protein Name：FAM189A2；（2）Organisms：Homo sapiens。

1.5 共表达基因聚类分析及分子调控网络构建

应用cBioportal数据库，获取TCGA数据库中FAM189A2在食管癌中的共表达基因，将共表达基因应用R语言转换为Gene ID后输入DAVID数据库，对相关度高的基因进行基因本体论（gene ontology，GO）及京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。

1.6 统计学分析

采用GraphPad Prism9软件进行统计学分析，采用t 检验统计分析FAM189A2在食管癌和正常食管组织中的差异，组间比较采用单因素方差分析，采用Kaplan-Meier法进行生存分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 FAM189A2在多种肿瘤及食管癌中的表达水平

根据设置的筛选条件，UACLAN数据库结果显示，与正常组织比较，FAM189A2在食管癌、乳腺癌、膀胱尿路上皮癌、结肠癌、头颈鳞状细胞癌、肺腺癌及肺鳞状细胞癌等多种肿瘤组织中呈低表达状态，且在多种肿瘤中的表达差异有统计学意义。GEPIA数据库分析结果显示，FAM189A2在包含食管癌在内的17种肿瘤中呈低表达、10种肿瘤中呈高表达，4种肿瘤中表达无差异。见图 1。

2.2 FAM189A2在食管癌中呈低表达

按照筛选条件检索GEPIA数据库，结果显示，与正常食管组织相比，食管癌组织中FAM189A2表达水平下调2.04倍（log Fold Change），差异有统计学意义（P < 0.001），见图 2A。在UACLAN数据库分析FAM189A2表达与食管癌的关系，结果显示差异也有统计学意义（P = 0.009），见图 2B，2个数据库分析得到相似的结果。进一步应用实时定量PCR检测本研究机构留存的15例食管癌患者标本中FAM189A2 mRNA表达水平，结果显示，FAM189A2在食管癌组织的表达水平（0.963±1.756）显著低于正常食管组织（1.559±1.457），差异有统计学意义（P < 0.05），见图 2C。说明FAM189A2在食管癌组织中呈低表达。

2.3 FAM189A2在不同分期食管癌中的表达情况

应用UALCAN数据库针对食管癌的分子分型进行在线分析。结果显示，与正常组织比较，FAM189A2在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期表达升高，且除Ⅰ期外，其余各期与正常组织表达水平均有差异（P < 0.05）。FAM189A2表达在性别、体质量、年龄、吸烟史、肿瘤病理分型、TP53突变状态方面与正常组织比较，差异均有统计学意义（P < 0.05），甲基化分析结果显示，食管癌组织中FAM189A2甲基化水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05），见图 3。

2.4 FAM189A2表达与疾病预后的相关性

应用GEPIA数据库分析FAM189A2表达水平与食管癌患者预后的关系，结果显示，FAM189A2低表达组总生存期（overall survival，OS）显著低于高表达组（HR=0.49，P = 0.001 9），见图 4。

2.5 FAM189A2共表达网络的构建及功能分析

应用STRING数据库在线分析，获得FAM189A2功能蛋白相互作用网络信息图谱，PPI富集P值为0.032 8，与FAM189A2存在相互作用的蛋白节点有10个，分别为TJP2、TSPO、C2orf61、TMEM200A、TMC1、WWP2、CDK18、TMEM121、BAAT、IDH3A，见图 5。检索cBioportal数据库，食管癌中FAM189A2共表达基因有9 871个（P < 0.05）。相关度最高的10个基因为SLC4A4、EMCN、NR3C2、ITM2A、ABCA8、ST6GALNAC3、CAPN6、SORBS2、TNXB、ARHGAP6。取FAM189A2相关的差异最显著250个共表达基因进行GO和KEGG分析，GO富集分析结果显示，FAM189A2的共表达基因主要参与细胞内信号传导、细胞-细胞黏附、细胞基质黏附、整合素介导的细胞黏附、转录正调控等生物学过程。KEGG通路富集分析结果显示FAM189A2的共表达基因主要参与PI3K-Akt信号通路、cGMP-PKG信号通路、肾素分泌、肿瘤通路、钙离信号通路、细胞黏附分子等信号通路。

3 讨论

食管癌分为鳞状细胞癌和腺癌，我国90%以上的分型为鳞状细胞癌^[6]，食管癌预后差，侵袭性高，确诊时多为晚期或已发生转移^[7]，虽然可以采用根治性手术切除治疗，但5年总体生存率仍较低^[8]。食管癌发生与吸烟、饮酒、饮食、感染、基因遗传等多种因素有关^[9]，虽然多家研究机构已将食管癌靶向药物应用于临床，但取得的效果并不确切^[10-13]。因此，寻找食管癌治疗的新靶点和预后标志物对食管癌的研究和治疗非常重要。

FAM189A2是FAM189家族成员，针对其功能开展的研究不多，有研究^[4]表明，FAM189A2可在质膜处与ITCH结合，增强ITCH介导的CXCR4泛素化，促进CXCR4表达，促进细胞迁移和干细胞化。FAM189A2在膀胱癌、结直肠癌、胃癌等肿瘤中呈现低表达^[14-16]，且与预后相关，但其在食管癌中研究较少。本研究利用多种生物信息学数据库结合基础实验分析FAM189A2在食管癌中的表达水平及临床意义。

应用UALCAN和GEPIA数据库对FAM189A2在泛癌中分析结果显示，FAM189A2在多种肿瘤中呈低表达状态，且差异有统计学意义。应用实时定量实验检测15例食管癌组织和正常食管组织中的FAM189A2 mRNA表达水平，结果显示，FAM189A2 mRNA在食管癌中低表达，与UALCAN和GEPIA数据库分析结果一致，说明FAM189A2在食管癌中的低表达可能促进肿瘤的发生。FAM189A2在不同分期的食管癌中表达有统计学差异，可作为食管癌分期的标志物。甲基化是DNA表观遗传学的重要修饰，可以减低基因的表达水平，数据库分析结果显示，FAM189A2在食管癌中甲基化水平升高，这可能是造成FAM189A2 mRNA低表达的主要因素。GEPIA数据库分析结果显示，FAM189A2低表达组总生存期显著低于高表达组，说明低表达的预后更差。

STRING数据库分析结果显示，FAM189A2可能与WWP2、TJP2等蛋白存在相互作用。WWP2是一种E3泛素化蛋白连接酶，是Nedd4家族E3连接酶的成员，在蛋白质泛素化中起重要的作用，可与肿瘤抑制因子PTEN相互作用调节致癌信号通路^[17-18]。TJP2是一种紧密连接蛋白，可以调节细胞周期蛋白D1的启动子活性，细胞周期蛋白D1参与细胞有丝分裂事件的时间协调，改变细胞周期进程，参与肿瘤的发生发展^[19]。

本研究对FAM189A2显著的共表达基因进行GO和KEGG分析，探索该基因参与的生物学过程及信号通路。GO富集结果显示，FAM189A2共表达基因主要参与细胞内信号传导、细胞-细胞黏附、转录正调控等生物学过程。KEGG分析结果显示，FAM189A2的共表达基因主要参与PI3K-Akt信号通路、cGMP-PKG信号通路、肿瘤通路等信号通路。

综上所述，FAM189A2在食管癌中呈低表达，且在不同分期的食管癌中有统计学差异，与年龄、性别、吸烟史、TP53突变状态具有相关性。FAM189A2的表达水平与患者预后密切相关，可作为食管癌新的预后标志物。目前，对于FAM189A2在食管癌中的作用机制较少，本研究通过生物信息学数据库和初步基础实验预测了FAM189A2参与食管癌发病的生物学过程和相关信号通路，为食管癌的机制研究提供了一定的理论基础。