青光增视方对青光眼大鼠模型视网膜神经节细胞保护机制的研究

http://dx.doi.org/10.12007/j.issn.0258-4646.2023.02.010

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姜艳华, 赵磊, 陈琳琳, 左韬

JIANG Yanhua, ZHAO Lei, CHEN Linlin, ZUO Tao

The protective mechanism of Qingguang Zengshi on optic nerve injury in rats with glaucoma via the PI3K/AKT pathway

中国医科大学学报, 2023, 52(2): 147-152, 159

Journal of China Medical University, 2023, 52(2): 147-152, 159

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收稿日期：2022-09-14

网络出版时间：2023-01-31 11:13:24

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姜艳华, 赵磊, 陈琳琳, 左韬. 青光增视方对青光眼大鼠模型视网膜神经节细胞保护机制的研究[J]. 中国医科大学学报, 2023, 52(2): 147-152, 159.

JIANG Yanhua, ZHAO Lei, CHEN Linlin, ZUO Tao. The protective mechanism of Qingguang Zengshi on optic nerve injury in rats with glaucoma via the PI3K/AKT pathway[J]. Journal of China Medical University, 2023, 52(2): 147-152, 159.

青光增视方对青光眼大鼠模型视网膜神经节细胞保护机制的研究

姜艳华^1,2 , 赵磊³ , 陈琳琳² , 左韬^1,3

1. 辽宁中医药大学第二临床学院中西医结合眼科, 沈阳 110032;
2. 中国医科大学沈阳市第四人民医院眼科, 沈阳 110031;
3. 辽宁中医药大学附属第二医院眼科, 沈阳 110034

收稿日期：2022-09-14；网络出版时间：2023-01-31 11:13:24

基金项目：辽宁省自然科学基金(2018010548-301)

作者简介：姜艳华(1982-), 女, 副主任医师, 博士.

通信作者：左韬, E-mail: ykzt208@163.com.

摘要：目的探究青光增视方对青光眼大鼠模型视神经的保护作用及对PI3K/AKT通路的调节作用。方法通过烧灼大鼠右眼巩膜表面静脉制作青光眼模型，给予高、中、低剂量（3.40、1.70、0.85 g·kg^-1·d^-1）青光增视方颗粒（青光增视方给药组）或甲钴胺（0.159 mg·kg^-1·d^-1）（西药组）灌胃，末次给药后检测大鼠眼压，观察视网膜神经节细胞（RGCs）的形态及超微结构，采用定量PCR及Western blotting检测视网膜PI3K、AKT、PTEN、eNOS mRNA及蛋白的表达情况。结果与空白组比较，其他各组大鼠眼压均显著升高，但青光增视方高、中剂量组眼压显著低于模型组和西药组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。与空白组比较，模型组PI3K、AKT、eNOS mRNA及PI3K、p-AKT/AKT、eNOS蛋白表达水平显著降低，PTEN mRNA及蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。与模型组比较，各给药组PI3K、AKT、eNOS mRNA及PI3K、p-AKT/AKT、eNOS蛋白表达水平显著升高，其中青光增视方给药组显著高于西药组；PTEN mRNA及蛋白表达水平显著降低，青光增视方给药组显著低于西药组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。结论青光增视方对青光眼大鼠模型的RGCs具有保护作用，其机制可能与调控PI3K、AKT、PTEN、eNOS的表达相关。

关键词：青光眼视神经损伤青光增视方磷脂酰肌醇-3激酶蛋白激酶B

The protective mechanism of Qingguang Zengshi on optic nerve injury in rats with glaucoma via the PI3K/AKT pathway

JIANG Yanhua^1,2 , ZHAO Lei³ , CHEN Linlin² , ZUO Tao^1,3

1. Ophthalmology Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The Second Clinical College of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, China;
2. Department of Ophthalmology, The Fourth People's Hospital of Shenyang, China Medical University, Shenyang 110031, China;
3. Department of Ophthalmology, The Second Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110034, China

Abstract: Objective To analyze the protective effect of Qingguang Zengshi on the optic nerve of rats with glaucoma and its effect on the phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) signaling pathway and its related factors. Methods Sprague Dawley rats were used to cauterize the scleral surface veins to create a right-eye glaucoma model.High, medium, and low doses (3.40, 1.70, and 0.85 g·kg^-1·d^-1) of Qingguang Zengshi (Qingguang Zengshi administration group) or methylcobalamin (0.159 mg·kg^-1·d^-1, Western medicine group) were administered by gavage.Intraocular pressure was measured after the final administration. The morphology and ultrastructure of retinal ganglion cells were observed. Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction and western blotting were used to determine the mRNA and protein expression levels, respectively, of retinal PI3K, Akt, PTEN, and eNOS. Results Compared with the blank group, the intraocular pressure of rats in the other groups increased significantly, but was significantly lower in the high and middle dosage Qingguang Zengshi administration groups than that in the model group and the Western medicine group (P < 0.05). Compared with the blank group, the expression levels of PI3K, AKT, and eNOS mRNA and PI3K, p-AKT/AKT, and eNOS proteins were significantly lower in the model group, and the expression levels of PTEN mRNA and protein were significantly higher in the model group (P < 0.05). Compared with the model group, the expression levels of PI3K, AKT, and eNOS mRNA and PI3K, p-AKT/AKT, and eNOS proteins were significantly higher in each administration group, and were significantly higher in the Qingguang Zengshi administration group than the Western medicine group. The expression levels of PTEN mRNA and protein were significantly reduced, and were significantly lower in the Qingguang Zengshi administration group than the Western medicine group (P < 0.05). Conclusion Qingguang Zengshi has protective effects on retinal ganglion cells in a rat model of glaucoma, and the mechanism may be related to the regulation of PI3K, AKT, PTEN, and eNOS expression.

Keywords: glaucoma optic nerve injury Qingguang Zengshi prescription phosphatidylinositol 3 kinase protein kinase B

青光眼是以病理性高眼压为危险因素，以视神经萎缩、视盘凹陷及视野缺损为临床征象的眼病。全球40岁及以上人群中青光眼的患病率为3.54%^[1]。青光眼是全球第二大致盲性眼病^[2]。视神经萎缩是青光眼致盲的最主要原因。中医药在治疗视神经萎缩方面由来已久，并深具独特优势。青光增视方是辽宁省名中医左韬教授基于30多年治疗青光眼临床经验总结出的经验方，具有补益肝肾、健脾利水、解郁明目之效，能够有效改善青光眼患者视力、视野，临床效果显著。本研究基于磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B (phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT) 信号通路研究青光增视方对青光眼大鼠模型视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs) 的保护作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级SD大鼠54只，雌雄不限，体质量(200±20) g，购自辽宁长生生物技术有限公司。

1.1.2 试剂

青光增视方(熟地黄20 g、山药9 g、白芍9 g、菟丝子9 g、茯苓6 g、泽泻6 g、菊花6 g、当归9 g、夏枯草9 g、香附9 g) 购自北京康仁堂药业。甲钴胺片(0.5 mg) 购自扬子江药业集团。蛋白提取、定量试剂盒，苏木精、伊红染色液购自杭州碧云天生物技术研究所；TUNEL染色试剂盒购自德国罗氏公司；兔抗大鼠PI3K检测试剂盒(ab140407)、p-PI3K检测试剂盒(ab278545)、兔抗大鼠AKT检测试剂盒(ab8805)、p-AKT检测试剂盒(ab38449)、兔抗大鼠磷酸酶-张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN) 检测试剂盒(ab267787)、兔抗大鼠内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS) 检测试剂盒(ab252439) 购自英国Abcam公司。

1.1.3 主要仪器及设备

手持眼压计(Tonolab，芬兰icare公司)；H-7560型透射电子显微镜(日本日立公司)；DM2000型数码显微镜、EM UC7型超薄切片机(德国徕卡公司)；EPS200型电泳仪、Tanon-4200SF凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组

SD大鼠饲养于辽宁中医药大学SPF级实验动物中心[SYYK (辽) 2019-0004]，湿度(42.5±4.5) %，温度(22.3±0.7) ℃，雌雄分开饲养。大鼠适应性饲养1周后，随机分为空白组、模型组、西药组、青光增视方高、中、低剂量组，每组9只。

1.2.2 模型制作

除空白组外，各组大鼠应用巩膜静脉烧灼法建立右眼慢性高眼压模型。造模前3 d予0.25%氯霉素滴眼液滴眼(3次/d)。造模当日，腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg) 麻醉，用0.5%丙美卡因滴眼液行眼表麻醉，测术眼眼压(intraocular pressure，IOP)，顺角膜缘做一放射状切口，暴露并分离上方筋膜肌肉，用加热处理的大头针对颞上、颞下以及鼻上象限3条上巩膜静脉进行烧灼，至清晰可见静脉呈充血状态。术后冲洗结膜囊，涂抹红霉素眼膏，监测IOP。烧灼巩膜表面静脉1周后，测量大鼠双眼IOP，术眼IOP > 21 mmHg或高于非术眼5 mmHg，视为建模成功，剔除不成模大鼠。

1.2.3 给药方法

1剂青光增视方生药折合成免煎颗粒为16 g，根据《药理实验方法学》，按成人(60 kg体质量) 日剂量(0.267 g·kg-¹·d-¹) 的6.36倍计算，折算后大鼠等效剂量为1.70 g·kg-¹·d-¹。高剂量=等效剂量×2，低剂量=等效剂量×0.5，计算出高、中、低剂量(灌胃) 分别为3.40、1.70、0.85 g·kg-¹·d-¹。西药组按照大鼠体质量进行甲钴胺(0.159 mg·kg-¹·d-¹) 灌胃。每周进行大鼠称重并调整给药量，按胃容积为0.1 mL/kg体质量灌胃(2次/d)。以上干预进行8周。

1.2.4 测量IOP

IOP测量由同一人完成。用药后第2、4、6、8周，于9：00至10：00测量大鼠双眼IOP，每个时间点连续测量5次，取中间3个值的平均值作为最终结果。

1.2.5 苏木素-伊红染色

处死大鼠，摘除右眼，4%多聚甲醛固定24 h，10%甲醛溶液固定72 h，常规石蜡包埋，连续切片(厚5 μm)，中性树胶封固。梯度乙醇脱蜡后，苏木素-伊红染色，光学显微镜下观察视网膜的形态。

1.2.6 RGCs凋亡情况观察

麻醉固定大鼠，摘除右眼，手术显微镜下剪除结膜、角膜、晶状体及玻璃体，2.5%戊二醛4 ℃固定剩余组织4 h，漂洗，1%四氧化锇固定90 min，经漂洗、脱水、浸透、包埋，修成2 mm×2 mm小块。透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM) 下观察观察RGCs形态。

1.2.7 定量反转录PCR (quantitative reverse transcrip-tase-mediated polymerase chain reaction，qRT-PCR) 法检测大鼠视网膜组织PI3K、AKT、PTEN、eNOS mRNA相对表达量

提取视网膜组织总RNA，逆转录合成cDNA，行qRT-PCR检测相关基因表达情况。PCR反应体系20 μL，反应条件：95 ℃10 min，95 ℃15 s，55 ℃ 50 s，55 ℃50 s，45个循环。Gapdh作内参照。2-^ΔΔCt法计算目的基因相对表达量，重复检测3次，取平均值。引物序列见表 1。

表 1 qRT-PCR引物序列 Tab.1 Sequences of qRT-PCR primers

Gene	PCR primer sequence (5’-3’)	Product length (bp)
PI3K	Sense：TCACTGGTACGATGACGAG	120
	Antisense：CATAGCAGCCCTGCTTACTG
Akt	Sense：CACAGGTCGCTACTATGCCA	154
	Antisense：GTAAGGAAGGGATGCCTAGAG
PTEN	Sense：CTGAGAGACATTATGACACCGC	186
	Antisense：TTACACCAGTCCGTCCTTTCC
eNOS	Sense：GCAACAAACCGAGGCAATC	217
	Antisense：GGTCCAGCCATGTTGAATACAG
Gapdh	Sense：CCCATCTATGAGGGTTACGC	150
	Antisense：TTTAATGTCACGCACGATTTC

表选项

1.2.8 Western blotting检测视网膜组织中PI3K、AKT、p-AKT、PTEN、eNOS蛋白表达水平

取-80 ℃保存的视网膜组织，将其剪碎、匀浆，裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清液，进行蛋白定量，上样行SDS-PAGE电泳，转膜，加入100 g/L脱脂奶粉后室温封闭1 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜，洗涤，加入二抗室温孵育1 h，洗涤，化学发光法显色，成像扫描分析系统保存图像。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示。多组间比较采用one-way ANOVA，两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠IOP比较

造模前，大鼠IOP为7~13 mmHg，平均(9.85±1.39) mmHg，双眼IOP比较差异无统计学意义(P > 0.05)。造模1周后，2只大鼠死亡，1只大鼠未出现IOP升高。造模成功大鼠双眼IOP比较差异有统计学意义(P < 0.01)。给药干预8周后，各组大鼠无死亡。

给药干预后，与空白组比较，其余各组大鼠右眼IOP显著升高(P < 0.01)；与模型组比较，青光增视方高、中剂量组IOP降低(P < 0.01)；与西药组比较，青光增视方高、中剂量组IOP降低(P < 0.05)。见表 2。

表 2 各组大鼠的IOP测定结果比较(x±s，mmHg) Tab.2 Comparison of the levels of IOP of each group (x±s, mmHg)

Group	n	IOP
Control	9	9.247±0.983
Model	8	22.38±1.228¹⁾
Methylcobalamin	9	21.37±1.247¹⁾
QGZS-low dose	8	21.34±1.542¹⁾
QGZS-middle dose	9	20.09±1.115^{1)，2)，3)，4)}
QGZS-high dose	8	20.10±1.447^1)，2)，3)
F		132.879
P		< 0.001
1) P < 0.01 vs control group；2) P < 0.01 vs model group；3) P < 0.05 vs methylcobalamin group；4) P < 0.05 vs QGZS-low dose group. QGZS，Qingguang Zengshi.

表选项

2.2 视网膜形态变化

苏木素-伊红染色结果显示，空白组视网膜各层组织结构清晰，完整，染色均匀，RGCs呈圆形或椭圆形，连续无间断排列。模型组RGCs损伤最显著，数量明显减少，连续性中断，胞内空泡样变性，核固缩。西药组、青光增视方低、中、高剂量组RGCs数量增多，胞内空泡样变性改变均有所改善，其中西药组、青光增视方高、中剂量组较为明显(图 1)。

A，control group；B，model group；C，methylcobalamin group；D，QGZS-low dose group；E，QGZS-middle dose group；F，QGZS-high dose group. 图 1 各组视网膜HE染色比较×400 Fig.1 Comparison of retinal HE staining ×400

图选项

2.3 RGCs凋亡情况

TEM下可见空白组RGCs胞体呈卵圆形，轮廓清晰，核仁、核膜清晰，染色质、细胞质均匀，线粒体丰富。模型组RGCs胞体变形，细胞核、线粒体肿胀，核周间隙增大。西药组RGCs胞体变形，核皱缩，染色质边聚，线粒体空泡化，微丝数量减少。青光增视方各组可见少量RGCs变性，细胞核可见，染色质略不均，线粒体轻度肿胀，微丝略减少(图 2)。

A，control group；B，model group；C，methylcobalamin group；D，QGZS-low dose group；E，QGZS-middle dose group；F，QGZS-high dose group. 图 2 各组RGCs超微结构比较×10 000 Fig.2 Comparison of ultrastructure of RGCs in different groups ×10 000

图选项

2.4 各组视网膜PI3K、AKT、PTEN、eNOS mRNA表达水平比较

与空白组比较，模型组PI3K、AKT、eNOS mRNA表达水平显著降低(P < 0.01)，PTEN mRNA表达水平显著升高(P < 0.01)；与模型组比较，各给药组PI3K、eNOS及青光增视方高、中剂量组AKT mRNA表达升高(P < 0.01，P < 0.05)，各给药组PTEN mRNA表达降低(P < 0.01，P < 0.05)；与西药组相比，青光增视方高、中、低剂量组PI3K及青光增视方高、中剂量组AKT、eNOS mRNA表达升高(P < 0.01，P < 0.05)，青光增视方高、中剂量组PTEN mRNA显著降低(P < 0.01)，见表 3。

表 3 各组视网膜组织中PI3K、AKT、PTEN、eNOS mRNA表达水平比较 Tab.3 Comparison of expression levels of PI3K, AKT, PTEN, eNOS mRNA in retina of each group

Group	PI3K	AKT	PTEN	eNOS
Control	1.000±0.067	1.000±0.060	1.000±0.027	1.000±0.016
Model	0.345±0.022¹⁾	0.827±0.047¹⁾	1.330±0.073¹⁾	0.698±0.057¹⁾
Methylcobalamin	0.529±0.096^1)，2)	0.717±0.056¹⁾	1.190±0.021^1)，2)	0.887±0.036^2)，3)
QGZS-low dose	0.669±0.063^1)，2)，4)	0.669±0.063^1)，5)	1.230±0.069^1)，5)	0.973±0.042²⁾
QGZS-middle dose	0.773±0.049^1)，2)，6)	1.010±0.077^2)，6)，7)	0.970±0.038^2)，6)，7)	1.100±0.011^2)，6)，8)
QGZS-high dose	0.853±0.052^{2)，3)，6)，7)}	0.985±0.099^4)，6)，7)	0.951±0.069^2)，6)，7)	1.340±0.112^{1)，2)，6)，7)，9)}
F	42.577	14.502	26.344	42.863
P	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
1) P < 0.01 vs control group；2) P < 0.01，3) P < 0.05 vs model group；4) P < 0.05，5) P < 0.01 vs methylcobalamin group；6) P < 0.05，7) P < 0.01 vs QGZS-low dose group；8) P < 0.05，9) P < 0.01 vs QGZS-middle dose group.

表选项

2.5 各组视网膜组织中PI3K、AKT、p-AKT、PTEN、eNOS蛋白表达比较

与空白组比较，模型组PI3K、p-AKT/AKT、eNOS蛋白表达水平显著降低(P < 0.01)，PTEN蛋白表达显著升高(P < 0.01)；与模型组比较，各给药组的PI3K、p-AKT/AKT、eNOS表达显著升高(P < 0.01)，PTEN表达显著降低(P < 0.01)；与西药组相比，青光增视方高、中、低剂量组PI3K、p-AKT/AKT及中剂量组eNOS蛋白表达显著升高(P < 0.01)，青光增视方高、中、低剂量组PTEN蛋白表达显著降低(P < 0.01)，见表 4、图 3。

表 4 各组视网膜组织中PI3K、AKT、p-AKT、PTEN、eNOS蛋白表达水平比较 Tab.4 Comparison of expression levels of PI3K, AKT, p-AKT, PTEN, and eNOS in retina of each group

Group	PI3K	p-AKT/AKT	PTEN	eNOS
Control	0.574±0.042	0.665±0.038	0.874±0.037	0.527±0.021
Model	0.435±0.026¹⁾	0.532±0.026¹⁾	1.263±0.033¹⁾	0.330±0.030¹⁾
Methylcobalamin	0.645±0.020^1)，2)	0.611±0.024^1)，2)	1.147±0.050^1)，2)	0.525±0.041²⁾
QGZS-low dose	0.746±0.061^1)，2)，3)	0.724±0.040^1)，2)，3)	1.057±0.013^1)，2)，3)	0.515±0.028²⁾
QGZS-middle dose	0.762±0.033^1)，2)，3)	0.815±0.019^{1)，2)，3)，4)}	0.756±0.031^{1)，2)，3)，4)}	0.833±0.022^{1)，2)，3)，4)}
QGZS-high dose	0.871±0.021^{1)，2)，3)，4)，5)}	0.896±0.007^{1)，2)，3)，4)，5)}	0.523±0.019^{1)，2)，3)，4)，5)}	0.552±0.039²⁾⁵⁾
F	106.145	135.953	415.982	161.632
P	0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001
1) P < 0.01 vs control group；2) P < 0.01 vs model group；3) P < 0.01 vs methylcobalamin group；4) P < 0.01 vs QGZS-low dose group；5) P < 0.01 vs QGZS-middle dose group.

表选项

1，control group；2，model group；3，methylcobalamin group；4，QGZS-low dose group；5，QGZS-middle dose group；6，QGZS-high dose group. 图 3 各组视网膜组织中的PI3K、AKT、p-AKT、PTEN、eNOS蛋白表达水平比较 Fig.3 Comparison of expression levels of PI3K, AKT, p-AKT, PTEN, and eNOS in retina of each group

图选项

3 讨论

中医学认为青光眼发病机制主要是由于风、火、痰、瘀等导致目中脉络闭塞、气血阻滞、目系失养，临床表现为视力下降、眼球胀痛等^[3]。青光增视方具有补益肝肾、健脾利水、解郁明目之功效，能够有效改善青光眼患者视力、视野。本研究通过动物实验探讨青光增视方在青光眼治疗中的作用机制。研究^[4-5]表明，青光眼以RGCs凋亡为主要特点，因此，抑制RGCs凋亡已成为青光眼治疗的研究热点。本研究中，青光增视方组大鼠RGCs数量较模型组增多，细胞内空泡样变性改变均有所改善。TEM下，青光增视方组在RGCs变性、细胞核、细胞染色质均匀程度、线粒体肿胀程度等方面均优于模型组。表明青光增视方对青光眼大鼠模型的RGCs具有保护作用。

AKT是PI3K的活化物质，主要传导PI3K始动的生物信息，从而发挥抗凋亡作用。本研究中，青光增视方可上调青光眼大鼠模型视网膜中PI3K、AKT mRNA及PI3K、p-AKT/AKT蛋白的表达。汪伟等^[6]发现，上调大鼠慢性高眼压模型p-Akt的表达可导致RGC自我保护和修复的治疗效应。相关研究^[7]显示，通过激活PI3K/AKT及其下游信号通路，可调控小胶质细胞极化。而小胶质细胞极化在青光眼视神经损伤中具有重要作用^[8]。小胶质细胞的p-AKT表达增加，可有效减轻视网膜高眼压损伤^[9]。ZHONG等^[10]研究发现，基于PI3K/AKT通路调控小胶质细胞的极化还可调节促炎和抗炎因子的产生。本研究显示，青光增视方还可下调青光眼模型大鼠视网膜中PTEN mRNA及蛋白表达。PTEN能阻断PI3K途径，降低RGCs凋亡率。PTEN与RGCs存活和轴突再生具有一定的关系，下调PTEN基因不仅能抑制RGCs凋亡，还能促进视神经轴突再生^[11-12]。此外，本研究还发现，青光增视方可上调青光眼模型大鼠视网膜中eNOSmRNA及蛋白表达。eNOS可促进细胞增殖，PI3K、AKT可作为eNOS的上游调控机制，抑制细胞凋亡。p-AKT可激活eNOS，促进内皮细胞合成一氧化氮，增加血流量及细胞摄氧量，保护视神经^[13-14]。付梅等^[15]也证实了可通过调控PI3K/AKT/eNOS信号通路发挥神经保护作用。

综上所述，本研究结果显示，青光增视方对青光眼模型大鼠的视神经具有保护作用，其机制可能是通过调控视网膜PI3K、AKT、PTEN、eNOS mRNA及蛋白的表达，从而减少视网膜RGCs凋亡。

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