周围神经损伤（peripheral nerve injury，PNI）常因切割、牵拉、压迫等外力损伤所致，造成神经干连续性受损和神经细胞脱髓鞘等坏死性损伤，主要表现为远端效应器发生萎缩，近端神经元发生凋亡、坏死等一系列的改变^[1-2]。目前，临床上短距离的神经缺失可在两断端间行神经吻合术，而长距离的神经缺失则需要借助神经导管或神经移植物^[3]。脱细胞神经移植物（acellular nerve graft，ANA）去除了具有抗原性的细胞及髓鞘部分，保存了完整的通道结构，具有较低的免疫原性和较好的组织相容性。前期动物实验证明应用ANA所构建的组织工程神经可通过搭建细胞再生通道、促进施万细胞（Schwann cells，SCs）分泌神经营养因子、引导轴突再生等发挥促进神经再生修复的作用^[4-5]。

脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophicfactor，BDNF）是一种具有神经营养作用的蛋白质，在维持神经元存活以及促进损伤神经修复再生方面发挥着不可替代的作用^[6-7]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（phosphatidylinositol-3-kinase /protein kinase B，PI3K/Akt）信号通路参与细胞增殖分化和生长的调节，在PNI的修复再生中扮演着重要的角色^[8]。MA等^[9]在坐骨神经横断损伤模型中证实PI3K/Akt信号通路参与了SCs增殖和迁移的过程。MAO等^[10]发现在背根神经节细胞轴突再生过程中，PI3K/Akt信号通路起到了关键作用。BDNF的作用机制目前尚不明确，本研究通过测定运动神经传导速度（motor nerve conduction velocity，MNCV）和胫前肌湿重比率，观察脊髓细胞形态结构，检测脊髓内BDNF和磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B，p-Akt）蛋白的表达，进一步阐明BDNF促进损伤神经再生修复的作用及其机制，为长距离神经损伤的康复治疗提供新的治疗靶点和实验基础。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

LY294002（M1925）购自美国Abmole公司；兔抗BDNF（A4873）、兔抗Akt1（A11016）、兔抗p-Akt1（phospho-Akt1-S473，AP0098）、HRP标记山羊抗兔IgG、兔抗ACTB（AC026）抗体购自美国ABclonal公司；尼氏染色液、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、快速凝胶试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。Tanon-6100全自动化学发光图像分析系统购自上海天能科技有限公司；生物显微镜（BX43、DP27）、荧光显微镜（BX43、DP73）和图像采集分析系统购自日本Olympus公司；BL-420I信息化集成化信号采集与处理系统购自成都泰盟软件有限公司。

1.2 实验动物分组和处理

SPF级雄性SD大鼠35只，体质量（200±20）g，购自北京华阜康生物科技有限公司，动物合格证编号SCXK（京）2019-0008。将大鼠置于12 h黑白交替、温度22~24 ℃、相对湿度65%~75%的饲养环境中。随机选取10只大鼠用于ANA制备，5只作为正常（N）组。其余20只大鼠先建立坐骨神经损伤模型：仔细分离、显露右侧坐骨神经，于梨状肌下缘约5 mm处用显微手术剪切除右侧坐骨神经10 mm。将模型大鼠随机分为模型（M）组、ANA组、抑制剂LY294002（LY）组、溶剂对照（LYC）组，每组5只。M组大鼠常规饲养，无任何操作；其余3组采用显微缝合技术将制备好的ANA与损伤神经的两断端进行端-端吻合；LY组在术后2 d腹腔注射LY294002（2.0 ng·mL^-1·kg^-1），连续注射4周。LYC组腹腔注射DMSO，操作、剂量和时间均同LY组。本研究获得承德医学院实验动物管理和伦理委员会批准（CDMCLAC-20201001-001），实验过程及操作均符合国家有关实验动物的管理和使用规定。

1.3 ANA制备

麻醉大鼠（2%戊巴比妥钠40 mg/kg，腹腔注射），于两侧股部行斜切口显露并分离双侧坐骨神经。用显微手术剪取双侧坐骨神经15 mm，置于专用容器内行如下脱细胞处理：于蒸馏水中浸泡12 h后，置于4.0%TritonX-100溶液中浸泡洗涤12 h；蒸馏水漂洗3 h；浸入3%脱氧胆酸钠溶液，于脱色摇床上持续振荡12 h（100次/min）；上述步骤重复1次；蒸馏水漂洗过夜；置于含抗生素的0.01 mol/L PBS中，4 ℃储存备用。

1.4 大鼠坐骨神经MNCV测定

采用BL-420I信息化集成化信号采集与处理系统检测各组大鼠坐骨神经MNCV。刺激参数如下：频率l Hz、强度10 mA、时间0.1 ms。麻醉大鼠，显露、分离坐骨神经至其分为腓总神经和胫神经处。于ANA两端分别放置钩形银针电极，近端施加刺激、远端进行记录，最后采用游标卡尺（精度为0.2 mm）测量2个电极之间的距离，依据MNCV（m/s）=两电极之间距离（mm）/动作电位潜伏期的差值（ms），计算各组大鼠坐骨神经MNCV。

1.5 胫前肌湿重比率计算

麻醉大鼠，灌注取材。切开大鼠小腿后缘皮肤，从跟骨结节游离至股骨内、外髁处，取下完整的胫前肌。将同一只大鼠健侧和患侧胫前肌分别放于分析天平上称量，根据胫前肌湿重比率=患侧胫前肌质量/健侧胫前肌质量，计算各组大鼠胫前肌湿重比率。

1.6 尼氏染色观察脊髓前角运动神经元的形态结构

取各组大鼠L_4~6脊髓，脱水处理后行OCT包埋，制成厚度约40 μm的冰冻切片。依次经梯度乙醇水化后放入尼氏染色液中浸染25 min，再经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后，于镜下观察并采集图像。应用Image Pro Plus 6.0图像分析软件对每个视野下着色尼氏体进行计数。每个脊髓组织随机选取3张切片，每张切片随机选择3个视野，取平均值。

1.7 检测脊髓内BDNF和p-Akt1蛋白的表达

1.7.1 免疫荧光染色

取各组大鼠L_4~6脊髓组织进行切片（处理同1.6）。切片经0.01 mol/L PBS洗涤3次，10 min/次，应用0.2% Triton-100透膜处理25 min，再经0.01 mol/L PBS洗涤3次，10 min/次，滴加山羊血清，于37℃恒温水浴箱内封闭1 h，甩去血清，分别加入兔抗BDNF抗体（1∶200）和兔抗p-Akt1抗体（1∶100），4 ℃冰箱孵育过夜。第2天，取出切片复温后，先用0.01 mol/L PBS洗涤3次，10 min/次，后滴加Cy3标记的山羊抗兔IgG（1∶400），37 ℃恒温水浴箱内孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗涤3次，10 min/次，应用荧光防淬灭剂封片，置于荧光显微镜下观察、采集图像。

1.7.2 Western blotting

采用RIPA蛋白裂解液提取各组大鼠L_4~6脊髓组织蛋白。BCA试剂盒测定蛋白浓度，配置40 μg上样体系，经电泳、转膜、封闭后加入兔抗BDNF（1︰1 000）、兔抗Akt1（1︰1 000）、兔抗p-Akt1（1︰1 000）、兔抗ACTB（1︰10 000），4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，时间为15、10、10 min。加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1︰8 000），室温孵育1 h，经TBST漂洗3次，10 min/次。ECL发光，用Tanon-6100全自动化学发光图像分析系统检测蛋白条带，以目的蛋白条带与标准蛋白条带的灰度比值作为目的蛋白的相对表达水平。

1.8 统计学分析

采用GraphPad Prism5软件对数据行统计学分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，进一步2组间比较应用Bonferroni-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠的一般状态

除N组外，其他4组大鼠术后患肢均出现严重的运动障碍，并出现舔舐、悬空等肢体保护动作，患肢无严重感染，个别出现溃烂、缺趾等现象。M组大鼠患肢运动障碍至4周时仍未改善，跛行严重；ANA组大鼠患肢运动障碍逐渐恢复，步态明显好于M组；LY组大鼠患肢运动障碍改善不明显。

2.2 坐骨神经MNCV

N组大鼠坐骨神经MNCV[（50.29±3.564）m/s]明显高于ANA组[（35.99±2.191）m/s]、LY组[（23.49±2.219）m/s]和LYC组[（32.13±2.832）m/s]（P < 0.05）；与ANA组比较，LY组大鼠坐骨神经MNCV明显降低（P < 0.05）。见图 1。

2.3 胫前肌湿重比率

M组、ANA组、LY组和LYC组胫前肌湿重比率分别为0.187 2±0.026 30、0.331 6±0.067 28、0.249 7±0.017 89、0.366 2±0.050 94，差异有统计学意义（F = 19.25，P < 0.05）；Bonferroni-t检验结果显示，ANA组胫前肌湿重比率明显高于M组（P < 0.05），LY组胫前肌湿重比率低于ANA组（P < 0.05）。见图 2。

2.4 脊髓前角运动神经元形态结构

尼氏染色结果显示，脊髓前角运动神经元中的尼氏体呈虎斑状、蓝紫色。M组大鼠脊髓前角运动神经元胞体肿胀，尼氏体溶解、形态结构不完整，虎斑状结构少见，染色较浅且不均匀；ANA组具有斑块状结构的尼氏体清晰可见，尼氏体着色较深且均匀，胞核多居于中央，偶见核移位现象；LY组尼氏体结构模糊、不完整，染色深浅不一。Image Pro Plus 6.0图像分析结果显示，ANA组尼氏体数量明显多于M组（P < 0.05），LY组尼氏体数量显著低于ANA组（P < 0.05）。见图 3。

2.5 脊髓内BDNF和p-Akt1蛋白的表达

免疫荧光染色可见各组大鼠脊髓内BDNF和p-Akt1蛋白均被标记为红色荧光，阳性产物主要位于脊髓前角运动神经元的细胞质。Western blotting半定量分析结果显示，M组BDNF和p-Akt1蛋白的表达水平明显低于N组（P < 0.05），ANA组显著高于M组（P < 0.05），LY组显著低于ANA组（P < 0.05）。见图 4。

3 讨论

PNI后的再生和修复是一个缓慢且复杂的过程。电生理检测是判断神经损伤程度及评估神经功能恢复情况的客观指标^[11]。神经纤维具有兴奋性和传导性，当神经损伤后，其传导性也会受到严重的影响，因此神经传导速度可准确反映周围神经的功能状态^[12]。本研究结果显示，ANA组MNCV明显高于M组，说明ANA起到了较好的桥接作用，使损伤部位的轴索得到了恢复，神经冲动得以传导。胫前肌是坐骨神经运动纤维支配的重要靶器官，其湿重比率增高也表明坐骨神经功能得到了改善。研究^[13]显示，PNI后约1/3的患者存在肌肉萎缩和肌无力现象。SHIMADA等^[14]发现抑制局部M1巨噬细胞的浸润可改善神经损伤所致肌肉萎缩，有助于神经功能的恢复。本研究结果显示，ANA组胫前肌湿重比率明显升高，表明ANA组坐骨神经功能得到了明显改善。分析其原因可能是在ANA所建立的再生通道下，神经的连续性得以恢复，从而维持了坐骨神经对胫前肌的营养支持，因此胫前肌的湿重比率明显增加。

神经再生的前提条件是存在可行使再生功能的胞体，因此脊髓前角运动神经元的形态结构、数量以及功能状态是影响神经再生的重要因素。神经元内的尼氏体是一种特异性的嗜色质，主要由平行排列的糙面内质网构成，其间散在游离的核糖体，光学显微镜下观察似“虎斑状”。神经元内尼氏体的形态结构越完整、数量越多，提示神经元中蛋白质的合成功能越活跃^[15]。FEI等^[16]发现，面神经损伤后运动核内尼氏体明显减少，经电针治疗后尼氏体数量明显增加，面神经的功能也逐步恢复。本研究中，尼氏染色显示坐骨神经损伤大鼠患侧脊髓前角外侧核中运动神经元发生了退行性变化，不仅神经元数目减少，尼氏体结构也变得模糊、甚至溶解/消失。经ANA处理后，神经元的形态结构逐渐恢复，尼氏体数量增多，虎斑小体清晰可见。提示ANA的桥接不仅起搭建再生通道的作用，还恢复了轴浆流动，使由靶组织所产生的神经营养因子可逆行运输到神经元胞体，从而减弱了神经元的坏死或凋亡。

研究^[17-18]表明，BDNF与其受体TrkB结合后，可发挥促进髓鞘再生以及运动和感觉功能恢复等作用。PI3K是一种膜蛋白，活化后使其下游因子Akt发生磷酸化，参与调控细胞的增殖、自噬、凋亡等多种病理生理过程^[19]。YIN等^[20]研究揭示BDNF表达增加的同时，PI3K/Akt信号通路的生物活性也增强，导致坐骨神经横断小鼠感觉和运动功能显著改善。另有研究^[21]显示，益母草总碱通过上调BDNF表达水平而调控PI3K/Akt通路，在脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用。王秀敏等^[22]发现，PI3K/Akt信号通路抑制剂可使BDNF合成减少，而该通路激动剂则可提高BDNF、p-Akt表达水平。本研究采用Western blotting和免疫荧光染色检测了脊髓内BDNF和p-Akt1蛋白的表达情况，发现ANA组脊髓内不仅BDNF表达升高，p-Akt1蛋白表达也呈上升趋势，提示表达升高的BDNF可能激活了PI3K/Akt信号通路。为了验证这一假说是否成立，本研究设置了LY组，即在ANA桥接术后腹腔注射PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002，结果发现LY组BDNF表达低于ANA组，且p-Akt1蛋白表达呈下降趋势。同时还发现LY组MNCV和胫前肌湿重比率明显低于ANA组，且脊髓前角外侧核中神经元的形态结构恢复及神经功能恢复也落后于ANA组。因此，推测高表达的BDNF可能部分地通过PI3K/Akt信号转导通路发挥了促进神经再生修复的作用。其机制可能为增加的BDNF与跨膜受体TrkB结合，使后者发生磷酸化，募集并激活PI3K，活化的PI3K进一步激活下游Akt，使其转化为p-Akt，继续激活下游的Bcl-2、Bax、NF-κB、mTOR等多种靶点分子，从而发挥促进损伤神经再生和修复的作用，但其具体机制有待进一步深入研究。