2023, Vol. 52文章信息
- 高利丽, 蔡宏宇, 刘彤崴
- GAO Lili, CAI Hongyu, LIU Tongwei
- 硒对高糖诱导的大鼠腹膜透析相关腹膜纤维化的影响
- Effects of selenium on peritoneal dialysis-related peritoneal fibrosis induced by high glucose in rats
- 中国医科大学学报, 2023, 52(1): 46-50
- Journal of China Medical University, 2023, 52(1): 46-50
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文章历史
- 收稿日期：2022-04-02
- 网络出版时间：2023-01-18 08:33:30
引用本文 |
2. 锦州医科大学附属第一医院心内科, 锦州 121001
2. Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China
腹膜透析是一种有效的居家肾脏替代疗法，全球约有196 000例终末期肾病患者接受腹膜透析治疗，占透析人群的11%~15%[1]。尽管随着透析方式和设备的改进，感染性腹膜炎的发病率明显降低，但腹膜透析相关腹膜纤维化仍是腹膜透析最主要的并发症，严重影响腹膜透析的效能，是患者退出腹膜透析的主要原因。腹膜作为半透膜，长期暴露于高糖腹膜透析液中可导致腹膜氧化应激的发生，最终导致腹膜纤维化[2]。硒是人体内一种重要的微量元素，具有抗氧化特性，可保护生物系统免受氧化损伤。低硒与多种疾病的发生、进展密切相关，如肾病、肝纤维化等。本研究通过观察硒对高糖诱导的大鼠腹膜透析相关腹膜纤维化的影响，探讨硒延缓腹膜透析相关腹膜纤维化的机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物和分组选用清洁级健康雄性SD大鼠40只，体质量200~250 g，8~10周龄。将大鼠随机分为对照组（NC组）、高糖组（HG组）、低硒组（HG+L-Se组）、高硒组（HG+H-Se组），每组10只。NC组腹腔注射无菌生理盐水（100 mL/kg），1次/d；HG组腹腔注射4.25%葡萄糖腹膜透析液（100 mL/kg），1次/d；HG+L-Se组腹腔注射4.25%葡萄糖腹膜透析液（100 mL/kg）和3 mg/kg亚硒酸钠，1次/d；HG+H-Se组腹腔注射4.25%葡萄糖腹膜透析液（100 mL/kg）和6 mg/kg亚硒酸钠，1次/d。各组大鼠均连续腹腔注射28 d。4.25%葡萄糖腹膜透析液由广州百特医疗用品有限公司提供。
1.2 检测指标和检测方法连续腹腔注射28 d后，给予大鼠2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。量取腹腔流出液，计算超滤量。眼球取血5 mL，静置，3 500 r/min离心10 min，分离血清，用于谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）活性检测。留取壁层腹膜组织，用于HE染色和免疫组织化学染色。
1.2.1 腹膜超滤量准确量取腹腔流出液，计算腹膜超滤量，腹膜超滤量（mL/kg）=（1 h后腹腔流出液的体积-初始腹腔注射腹膜透析液体积）/体质量。
1.2.2 HE染色大鼠腹膜组织经4%多聚甲醛固定24 h后，常规脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋切片，行HE染色，观察病理表现，每张切片随机选取5个视野。
1.2.3 免疫组织化学染色石蜡包埋的大鼠腹膜组织4 μm切片，利用柠檬酸缓冲液高压修复，一抗上皮钙黏蛋白（E-cadherin）（1∶100）、波形蛋白（vimentin）（1∶500）4 ℃孵育过夜。染色结束后，于倒置显微镜下随机选取5个视野，按阳性比例进行评分。评分标准：阴性，0分；≤20%，1分；> 20%~50%，2分；> 50%~80%，3分；> 80%~100%，4分。
1.2.4 氧化应激指标按照GSH、MDA、T-SOD检测试剂盒（南京建成科技有限公司）说明书进行操作，检测大鼠血清中GSH和MDA的含量，T-SOD活性。
1.3 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件处理数据，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 硒对大鼠腹膜功能的影响腹膜超滤功能结果显示，与NC组相比，HG组1 h腹膜超滤量明显减少（P < 0.05），HG+L-Se组、HG+H-Se组减少不明显（P > 0.05）；与HG组相比，HG+L-Se组1 h腹膜超滤量增加，但差异无统计学意义（P > 0.05），而HG+H-Se组1 h腹膜超滤量明显增加（P < 0.05）；HG+H-Se组与HG+L-Se组比较，1 h腹膜超滤量无统计学差异（P > 0.05）。见表 1。
| Group | Ultrafiltration volume（mL/kg） | Peritoneal thickness（μm） | E-cadherin protein | Vimentin protein |
| NC | 23.89±4.63 | 34.34±7.63 | 2.00±0.21 | 1.50±0.22 |
| HG | 6.46±4.341） | 90.01±11.741） | 0.80±0.121） | 3.34±0.351） |
| HG+L-Se | 13.83±6.55 | 53.36±10.70 | 1.30±0.15 | 2.52±0.38 |
| HG+H-Se | 22.29±4.022） | 36.83±3.122） | 1.83±0.172） | 1.80±0.142） |
| 1）P < 0.05 vs NC group；2）P < 0.05 vs HG group. | ||||
2.2 硒对大鼠腹膜组织形态学的影响
HE染色结果（图 1）显示：NC组大鼠腹膜组织覆盖一层扁平间皮细胞；HG组腹膜厚度增加，间皮下基质疏松，炎症细胞浸润纤维，胶原大量沉积；而HG+L-Se组、HG+H-Se组上述腹膜形态较HG组明显改善。通过Image-Pro Plus软件分析腹膜厚度，结果显示，与NC组相比，HG组腹膜厚度明显增加（P < 0.05），HG+L-Se组、HG+H-Se组增加不明显（P > 0.05）；与HG组相比，HG+L-Se组腹膜厚度减少，但差异无统计学意义（P > 0.05），HG+H-Se组腹膜厚度明显减少（P < 0.05）；HG+H-Se组与HG+L-Se组比较，腹膜厚度无统计学差异（P > 0.05）。见表 1。
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| A, NC group; B, HG group; C, HG+L-Se group; D, HG+H-Se group. 图 1 4组大鼠腹膜组织HE染色 ×200 Fig.1 HE staining of rat peritoneum in the four groups ×200 |
2.3 硒对大鼠腹膜组织EMT的影响
免疫组织化学染色结果（图 2）显示：与NC组相比，HG组E-cadherin蛋白表达明显降低，vimentin蛋白表达明显增加（均P < 0.05）；与HG组相比，HG+L-Se组E-cadherin蛋白表达增加，vimentin蛋白表达降低，但差异无统计学意义（均P > 0.05），HG+H-Se组E-cadherin蛋白表达明显增加，vimentin蛋白表达明显降低（均P < 0.05）；HG+L-Se组、HG+H-Se组与NC组比较，HG+H-Se组与HG+L-Se组比较，E-cadherin蛋白和vimentin蛋白的表达均无统计学差异（均P > 0.05）。见表 1。
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| 图 2 免疫组织化学染色检测4组大鼠腹膜E-cadherin和vimentin的表达 ×200 Fig.2 Expression of E-cadherin and vimentin in rat peritoneum in the four groups determined by immunohistochemistry ×200 |
2.4 硒对大鼠血清MDA和GSH含量、T-SOD活性的影响
与NC组比较，HG组大鼠血清MDA含量明显增加，GSH含量、T-SOD活性明显降低（均P < 0.05）；与HG组比较，HG+L-Se组血清MDA含量降低，GSH含量、T-SOD活性升高，但差异均无统计学意义（均P > 0.05），HG+H-Se组血清MDA含量明显降低，GSH含量、T-SOD活性明显升高（均P < 0.05）；HG+L-Se组、HG+H-Se组与NC组比较，HG+H-Se组与HG+L-Se组比较，MDA含量、GSH含量、T-SOD活性均无统计学差异（均P > 0.05）。见表 2。
| Group | GSH（mg/L） | T-SOD（U/ml） | MDA（nmol/ml） |
| NC | 175.00±6.04 | 108.80±2.25 | 5.80±0.62 |
| HG | 154.00±2.491） | 86.25±3.071） | 7.82±0.471） |
| HG+L-Se | 160.60±1.80 | 98.75±3.57 | 6.57±0.22 |
| HG+H-Se | 165.20±3.202） | 103.50±1.842） | 6.02±0.552） |
| 1）P < 0.05 vs NC group；2）P < 0.05 vs HG group. | |||
3 讨论
目前，越来越多的终末期肾病患者选择腹膜透析治疗。但长期接触非生理性腹膜透析液会引起腹膜形态和功能的改变，导致腹膜透析相关的腹膜纤维化，引发超滤失败。研究[3]表明，腹膜纤维化早期机制是腹膜间皮细胞EMT，其具有可逆性。EMT的主要特征是上皮细胞表型丧失，如E-cadherin降低等。细胞骨架由细胞角蛋白转化，以vimentin为主，并产生大量的细胞外基质成分胶原等。因此，本研究通过向大鼠腹腔注入4.25%葡萄糖透析液[4]，成功建立大鼠腹膜纤维化模型，并将vimentin和E-cadherin蛋白表达作为EMT的生物标志物。
氧化应激存在于慢性肾脏疾病的早期阶段。正常情况下，酶系统如T-SOD、GSH等能迅速清除体内过多的氧自由基，阻断氧自由基堆积引起的细胞损害，并修复受损的细胞。GSH作为活性氧清除剂，能够调节细胞内的氧化还原状态。随着肾功能的恶化，氧化应激逐渐增强，肾脏替代治疗会进一步加重氧化应激。有研究[5]指出，腹膜透析患者体内氧化应激反应的发生比透析前的终末期肾病患者增加更多。腹膜透析液中的终末期产物能够引起腹膜氧化应激的发生，其通过多种途径产生大量活性氧，导致纤维连接素表达上调，细胞外基质沉积，炎症介质释放，促纤维化细胞因子如转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β、TGF-α、血管内皮生长因子等高表达，最终导致腹膜纤维化[6]。研究[7-9]表明，在慢性阻塞性肺疾病等疾病中，氧化应激可以促进EMT的发生。由于氧化应激产生的TGF-β、TNF-α等细胞因子与EMT密切相关，因此氧化应激是腹膜EMT的一个危险因素。
抗氧化剂可改善上述变化。研究[10]发现，肾小管上皮缺氧时可通过氧化应激导致EMT，而肝纤维化中星状细胞可通过降低脂质过氧化水平，抑制氧化应激反应，逆转其向肌纤维母细胞的转化。硒是人类必需的微量元素，它可以减轻炎症反应，维持免疫系统功能。硒缺乏会导致免疫系统功能障碍，增加透析患者的心血管疾病死亡风险[11]。硒还具有抗氧化特性，补充硒可以减轻氧化应激和炎症状态[12]。硒是抗氧化防御机制的重要成分，也是谷胱甘肽过氧化物酶的必需成分，谷胱甘肽过氧化物酶在GSH或其他硫醇的共同作用下，清除活性氧，保护膜结构，保护脂蛋白、DNA等生物大分子，参与炎症调节等作用。研究[13]发现，硒缺乏会导致肾脏中硒浓度降低，氧化应激水平增加，从而导致足细胞受损，滤过屏障受损，产生蛋白尿。而补充硒可增加谷胱甘肽过氧化物酶的含量，减少活性氧自由基的生成，从而减轻肾脏足细胞的氧化损伤。一些研究[14-15]表明，接受持续不卧床腹膜透析患者的硒浓度低于健康对照者，且硒缺乏程度与氧化应激密切相关。据此推测，硒可能通过抑制氧化应激反应来抑制EMT，进而调控腹膜纤维化的进程。
本研究发现，补充硒可改善腹膜透析大鼠的腹膜功能，延缓腹膜纤维化，主要表现为增加腹膜超滤量，降低腹膜厚度，减少炎症细胞浸润。免疫组织化学结果进一步提示，与EMT相关的vimentin蛋白表达在补硒治疗后降低，而E-cadherin蛋白表达升高，说明硒可以逆转腹膜透析大鼠腹膜的EMT进程。而血清MDA含量在补硒治疗后明显降低，GSH含量、T-SOD活性提高。由于MDA是脂质过氧化物产物，而GSH、SOD是氧自由基的清除剂，其含量改变提示硒的抗氧化作用可能是通过激活抗氧化酶、改善氧化应激过程而实现的，其可能通过阻断氧化应激发挥潜在的腹膜保护作用，且浓度越高效果越明显。因此，补充硒可以改变组织抗氧化酶活性，抑制氧化应激反应，进而抑制大鼠腹膜间皮细胞的EMT。
综上所述，本研究表明，硒可通过上调血清中GSH含量、T-SOD活性，减少MDA蓄积，从而改善机体氧化应激，阻抑大鼠腹膜间皮细胞EMT。这为硒在腹膜透析相关腹膜纤维化中的作用和机制提供了新的科学依据，其具体机制仍需进一步探讨。
| [1] |
ROUMELIOTIS S, DOUNOUSI E, SALMAS M, et al. Unfavorable effects of peritoneal dialysis solutions on the peritoneal membrane: the role of oxidative stress[J]. Biomolecules, 2020, 10(5): 768. DOI:10.3390/biom10050768 |
| [2] |
BONOMINI M, MASOLA V, PROCINO G, et al. How to improve the biocompatibility of peritoneal dialysis solutions (without jeopardizing the patient's health)[J]. Int J Mol Sci, 2021, 22(15): 7955. DOI:10.3390/ijms22157955 |
| [3] |
LHO Y, DO JY, HEO JY, et al. Effects of TGF-β1 receptor inhibitor GW788388 on the epithelial to mesenchymal transition of peritoneal mesothelial cells[J]. Int J Mol Sci, 2021, 22(9): 4739. DOI:10.3390/ijms22094739 |
| [4] |
ZHOU L, ZONG M, GUAN QN, et al. Protection of the peritoneal membrane by peritoneal dialysis effluent-derived mesenchymal stromal cells in a rat model of chronic peritoneal dialysis[J]. Stem Cells Int, 2019, 2019: 8793640. DOI:10.1155/2019/8793640 |
| [5] |
INNICO G, GOBBI L, BERTOLDI G, et al. Oxidative stress, inflammation, and peritoneal dialysis: a molecular biology approach[J]. Artif Organs, 2021, 45(10): 1202-1207. DOI:10.1111/aor.14001 |
| [6] |
HAN SM, RYU HM, SUH J, et al. Network-based integrated analysis of omics data reveal novel players of TGF-β1-induced EMT in human peritoneal mesothelial cells[J]. Sci Rep, 2019, 9(1): 1497. DOI:10.1038/s41598-018-37101-9 |
| [7] |
胡进秀, 崔节达, 郭晓桐, 等. 氧化应激对慢性阻塞性肺疾病上皮-间质转化的影响[J]. 宁夏医科大学学报, 2021, 43(11): 1135-1140. DOI:10.16050/j.cnki.issn1674-6309.2021.11.008 |
| [8] |
DI GREGORIO J, ROBUFFO I, SPALLETTA S, et al. The epithelialto-mesenchymal transition as a possible therapeutic target in fibrotic disorders[J]. Front Cell Dev Biol, 2020, 8: 607483. DOI:10.3389/fcell.2020.607483 |
| [9] |
THUAN DTB, ZAYED H, EID AH, et al. A potential link between oxidative stress and endothelial-to-mesenchymal transition in systemic sclerosis[J]. Front Immunol, 2018, 9: 1985. DOI:10.3389/fimmu.2018.01985 |
| [10] |
FARZAEI MH, ZOBEIRI M, PARVIZI F, et al. Curcumin in liver diseases: a systematic review of the cellular mechanisms of oxidative stress and clinical perspective[J]. Nutrients, 2018, 10(7): 855. DOI:10.3390/nu10070855 |
| [11] |
JENKINS DJA, KITTS D, GIOVANNUCCI EL, et al. Selenium, antioxidants, cardiovascular disease, and all-cause mortality: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J]. Am J Clin Nutr, 2020, 112(6): 1642-1652. DOI:10.1093/ajcn/nqaa245 |
| [12] |
HARIHARAN S, DHARMARAJ S. Selenium and selenoproteins: it's role in regulation of inflammation[J]. Inflammopharmacology, 2020, 28(3): 667-695. DOI:10.1007/s10787-020-00690-x |
| [13] |
杜若梅, 王喜悦, 岳锐, 等. 低硒对足细胞的影响及其机制的相关研究进展[J]. 临床内科杂志, 2021, 38(8): 569-570. DOI:10.3969/j.issn.1001-9057.2021.08.023 |
| [14] |
PAKFETRAT M, MALEKMAKAN L, HASHEMINASAB M. Diminished selenium levels in hemodialysis and continuous ambulatory peritoneal dialysis patients[J]. Biol Trace Elem Res, 2010, 137(3): 335-339. DOI:10.1007/s12011-009-8588-2 |
| [15] |
RYUGE A, KIM H, SUZUKI Y, et al. Refractory hypotension caused by selenium deficiency in a patient on peritoneal dialysis[J]. Intern Med, 2021, 60(15): 2461-2464. DOI:10.2169/internalmedicine.6632-20 |