假体周围骨溶解（periprosthetic osteolysis，PPOL）是影响人工假体寿命的主要限制因素之一。研究^[1]发现，全髋人工关节置换术后约5.5%的患者和3.1%的全膝人工关节置换术患者接受了PPOL导致的翻修手术。人工关节的翻修手术具有巨大的挑战性，可能伴随严重的并发症^[2]。最近的研究^[3]表明，假体-骨界面产生的磨损颗粒诱发慢性炎症并破坏骨稳态，诱发PPOL，进而导致假体无菌性松动，因此，防止PPOL的关键在于抑制磨损微粒诱导的骨溶解反应。研究^[4]显示，微RNA（microRNA，miRNA）参与的基因调控对靶基因的表达可产生广泛影响。miR-217在肾小球系膜细胞、乳腺癌上皮细胞和肝癌细胞中发挥多种生物学功能^[5]。本研究拟构建小鼠胫骨PPOL模型，探讨miR-217在钛微粒诱导骨溶解中的作用机制，以期为PPOL的防治提供新靶点和组织工程化相关数据。

1 材料与方法 1.1 实验动物、试剂及仪器

12周龄成年雄性C57BL/6小鼠（购自中国医科大学实验动物中心）40只，体质量（25±2）g。兔抗鼠矮小相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）抗体、抗骨桥蛋白（osteopontin，OPN）抗体（美国Sigma公司），GAPDH抗体（北京中杉金桥生物有限公司），miR-217 mimics（上海吉凯基因医学科技股份有限公司），TRIzol试剂（美国Thermofisher公司），ABIPrism7500序列检测系统（美国Beyotime公司）。

1.2 磨损颗粒制备

100%无水乙醇浸泡去内毒素处理后钛颗粒，离心，紫外线下照射24 h，浸泡于无菌PBS，4 ℃放置待用。

1.3 动物模型建立

采用针植入加钛颗粒手术方法建立小鼠胫骨PPOL动物模型。10%水合氯醛腹腔注射（30 mg/kg）麻醉小鼠，选择右膝关节髌骨旁内侧切口，长度5 mm，暴露胫骨平台，0.8 mm牙钻钻孔至胫骨骨髓腔，孔直径1 mm，深5 mm。用钛合金针将10 μL钛颗粒悬浮液（4×10⁴个钛颗粒）注入胫骨髓腔，对位分层缝合，建立小鼠胫骨PPOL动物模型；术后1 d，将小鼠随机分为对照组和实验组，每组20只。实验组注射miR-217 mimics 50 μL（1.86 μg/μL）于PPOL区域，对照组注射50 μL PBS。

1.4 micro-CT扫描

针植入加钛颗粒术后1周和2周时，分别取2组小鼠胫骨骨组织，行micro-CT扫描及micro-CT自带软件（SkyScan1176，比利时Kontich公司）检测分析胫骨显微结构参数[骨密度、骨矿物质含量和骨体积比（bone volume ratio，BV/TV）]。

1.5 实时定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）

用TRIzol试剂提取总RNA，Nanodrop2000测定RNA浓度和纯度。用primematipt混合RT随机引物逆转录mRNA。用TRIzol逆转录miRNA。采用PrimeScript RT Master Mix和ABIPrism7500序列检测系统行cDNA扩增。以GAPDH和U6作内参照，每个样品重复3次。用2^-ΔΔCt法分析相对表达量。采用不同引物检测环状RNA的后剪接，采用聚合引物检测线性mRNA。miRNA和mRNA引物序列见表 1。

1.6 Western blotting

采用放射免疫沉淀法提取总蛋白。8%或10%SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜。加入兔抗鼠Runx2（1∶250）和OPN（1∶250）抗体，孵育过夜。PBS洗膜后加入过氧化物酶耦联的二抗，37 ℃下孵育2 h，PBS清洗后，用FDbio-Femto ECL和Bio-Rad化学发光系统检测目的条带。以GAPDH抗体（1∶2 500）作内参照。

1.7 统计学分析

采用Prism 7.0软件进行统计学分析。计量资料用x±s表示。采用Shapiro-Wilk检验分析数据是否符合正态分布，采用Levene方法进行方差齐性检验。采用未配对的Student’s t检验（符合正态分布和方差齐数据）、Welch t检验（符合正态分布方差不齐数据）或Mann-Whitney U检验（非正态分布数据）进行2组间比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 针植入加钛颗粒手术对PPOL动物的影响

本研究中，采用针植入加钛颗粒手术构建PPOL小鼠模型。手术后0~2周，实验组所有PPOL小鼠的行为、饮食水量与对照组小鼠无差异，手术区下肢膝关节切口处无感染流脓，PPOL区域未见骨折和钛颗粒溢出。

2.2 miR-217对PPOL小鼠胫骨骨性微结构的影响

miR-217 mimics注入实验组小鼠胫骨骨溶解病变处1周时，PPOL胫骨内骨溶解有明显减弱（图 1）；2周时，实验组小鼠胫骨的骨密度、骨矿物质含量及BV/TV均较对照组显著升高（图 2），差异有统计学意义（P < 0.05）。表明miR-217 mimics可有效改善PPOL小鼠胫骨的骨溶解病理效应。

2.3 miR-217干预PPOL小鼠骨组织内Runx2/OPN mRNA和蛋白的表达

miR-217 mimics注入PPOL模型胫骨骨溶解病变处1周时，Runx2、OPN mRNA和蛋白的表达水平显著升高（图 3、4）；注入2周时，PPOL小鼠胫骨骨组织内Runx2、OPN mRNA表达水平显著高于1周时，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

PPOL是导致人工关节置换手术失败的主要原因。假体磨损产生的微粒能诱导骨髓巨噬细胞和破骨细胞过度分泌炎性细胞因子，在假体周围形成异物（肉芽肿性界膜组织），进而发生无菌性炎症，使得骨质溶解破坏失代偿，最终导致假体松动^[6]。

PPOL是关节置换术的主要长期并发症，严重影响人工关节假体的使用寿命。人工假体周围组织中骨转换的平衡不仅取决于破骨细胞介导的骨吸收，还取决于成骨细胞形成新骨，这2个过程在生理条件下维持体内平衡^[7]。研究^[8]证实，Runx2/OPN在骨髓间充质干细胞的成骨分化、骨组织的骨质形成和基质钙化过程中具有重要作用，而Runx2蛋白可抑制炎性细胞因子诱导的PPOL。本研究结果显示，外源性miR-217作用PPOL小鼠2周后，可显著提高PPOL小鼠胫骨的骨密度及骨矿物质含量，有效改善PPOL小鼠胫骨的骨溶解病理效应。

miRNA具有单链非编码RNA分子稳定结构，通常以细胞和组织特异性的方式发挥作用。随着高通量RNA测序技术和生物信息学的发展，大量的研究^[9]证实miRNA参与多种疾病的发生与进展。miR-384-5p可通过直接与Gli2 mRNA的3’-UTR端结合，抑制Gli2 mRNA和蛋白的表达水平，具有成骨负调节作用^[10]；miR-132-3p可能通过Smad5调节成骨细胞对周期性张应力的分化^[11]；miR-124 mimics可以通过靶基因Sp7调节成骨细胞内成骨相关基因ALP和OCN的表达^[12]。MENSÀ等^[13]发现，由衰老的人脐静脉内皮细胞的外泌体携带的mir-21-5p/mir-217可传递促衰老信号，影响mRNA和DNA的甲基化，进而影响内皮细胞的增殖。目前尚未见miRNA参与骨溶解病理效应的相关报道。本研究结果显示，在PPOL小鼠胫骨骨组织内，外源性miR-217 mimics可显著增强Runx2和OPN的蛋白表达，改善钛颗粒诱导的PPOL效应。

Runx2和OPN是成骨细胞内成骨关键分子，在骨形成过程中具有重要的调控作用。Runx2属于RUNX家族的一员，是脊椎动物中的关键调控蛋白，参与胚胎发育发育、造血、血管发生、肿瘤发生和免疫反应。Runx2在骨稳态中也起着重要作用。有关男性骨质疏松性骨折的研究^[14]发现，Runx2可能是调控人类皮质和骨小梁体积骨密度的潜在骨形成遗传靶点。YANG等^[15]发现，Runx2在骨折早期修复过程中表达水平升高，使得破骨细胞的活性增强。OKA等^[16]报道，敲除Runx2基因会使小鼠骨矿化受损，导致骨骼发育不良和骨质疏松表型。在破骨细胞中，miR-217可抑制RANKL和CXCL12的表达，从而抑制破骨细胞活性，促进骨钙盐沉积^[17]；miR-217还可通过激活Wnt/β-catenin信号通路，促进成骨细胞的分化成熟^[18]；但miR-217在PPOL中对OPN/Runx2的作用还不明确。本研究探讨了miR-217对成骨细胞因子OPN/Runx2的干预作用，证实在小鼠PPOL胫骨骨组织内miR-217可促进OPN/Runx2的蛋白表达，增加PPOL小鼠的骨密度，从而抑制PPOL效应。

综上所述，本研究系统性地探讨了钛颗粒诱导的小鼠PPOL病理过程中miR-217对胫骨骨组织成骨作用的影响，发现miR-217可促进胫骨骨组织内Runx2和OPN mRNA和蛋白表达，显著增高胫骨骨密度及骨矿物质含量，有效改善PPOL小鼠胫骨的骨溶解病理效应。