2022, Vol. 51文章信息
- 檀畅, 王喜良, 张金艳, 魏威, 邹朋书, 罗丽双, 于月新
- TAN Chang, WANG Xiliang, ZHANG Jinyan, WEI Wei, ZOU Pengshu, LUO Lishuang, YU Yuexin
- 精子DNA碎片指数对体外受精不同助孕方式妊娠结局的影响
- Effect of male sperm DNA fragmentation index on the pregnancy outcomes of different methods of in vitro fertilization
- 中国医科大学学报, 2022, 51(9): 817-820, 825
- Journal of China Medical University, 2022, 51(9): 817-820, 825
-
文章历史
- 收稿日期：2021-11-16
- 网络出版时间：2022-08-15 9:36
引用本文 |
随着辅助生殖技术的不断发展, 男性不育日益引起人们的关注。评估男性生育力的传统指标主要包括精液体积、精子浓度、活力、前向运动能力和精子形态等常规质量参数。但有研究[1-2]显示, 精液常规化验结果正常的男性中仍有15%不育。由此可见, 常规精液分析对男性不育的临床诊断和生育力评估存在局限。随着精子研究的不断深入, 评价DNA损伤程度的精子DNA碎片指数(DNA fragmentationindex, DFI)逐渐成为评价男性精子质量的一项新指标。DFI是指在精子生成和成熟过程中, 由于精子DNA完整性被破坏而产生断裂碎片的程度。研究[3]报道, DFI升高会降低体外受精(in vitro fertilization, IVF)周期的妊娠率, 但对卵胞质内单精子注射(intra-cytoplamsic sperm injection, ICSI)周期没有影响。有研究[4]持相反意见, 认为DFI对精子受精能力和妊娠结局有重要影响, 精子DNA一旦被破坏, IVF或ICSI周期的妊娠率都会下降。目前, DFI对IVF/ICSI新鲜移植周期妊娠结局的影响尚无定论。因此, 本研究探讨了DFI对不同助孕方式妊娠结局的影响。
1 材料与方法 1.1 研究对象和分组收集2019年1月1日至2020年12月31日在我院生殖医学科接受IVF/ICSI助孕并新鲜移植的683对不孕夫妇(683个周期)的临床资料, 其中IVF 367个周期, ICSI 316个周期。
纳入标准: (1)女方年龄≤40岁; (2)女方抗米勒管激素≥1.1 ng/mL; (3)取卵日获卵数≥5个; (4)均为新鲜移植周期。排除标准: 男女双方染色体异常; 体格检查有生殖道外伤史、器质性病变; 女方卵巢储备功能低下, 基础窦卵泡数 < 5个; 卵母细胞冷冻周期等。
将全部研究对象、IVF周期和ICSI周期分别根据DFI值分为3组: DFI≤15%组, 精子DNA完整性较好; DFI > 15%~30%组, 精子DNA完整性一般; DFI > 30%组, 精子DNA完整性较差。比较不同DFI组间精液参数及IVF/ICSI新鲜移植周期妊娠结局的差异。
比较IVF周期和ICSI周期患者的一般资料, 包括男女双方年龄和体质量指数、女方获卵数, 均无统计学差异(P > 0.05）, 具有可比性。
1.2 方法 1.2.1 精液分析按照第5版世界卫生组织《人类精液检查与处理实验室手册》的操作标准, 禁欲3~7 d后, 手淫收集精液到无菌精液杯中, 液化后吸取10 μL至Makler计数池, 通过全自动精子分析仪操作系统CASA (美国Hamilton Thorne)进行精子浓度、前向运动精子百分率(progressive motility, PR)等常规检测。Diff-Quik染色法评估至少200个没有重叠的完整精子形态, 人工对比单个异常形态精子, 计算正常精子形态率(normal sperm morphology rate, NSMR）。
1.2.2 精子DFI检测采用流式细胞仪(美国BD AccriC6)检测, 按照精子核完整性染色试剂盒(浙江星博生物科技)说明书操作。经吖啶橙染色后上流式细胞仪检测荧光, DFI (%）=绿色荧光数/ (绿色荧光数+红色荧光数)×100。
1.2.3 体外受精与胚胎移植当优势卵泡直径≥18 mm时, 肌肉注射人绒毛膜促性腺激素, 34~36 h后经阴道B超穿刺取卵, 取出的卵细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养备用。取卵日当天男方手淫留取精液, 密度梯度离心上游法处理精液, 根据精子上游后情况确定助孕方案。对于严重少弱畸精、穿刺取精、冻精复苏和有过IVF助孕失败者行ICSI助孕, 精液正常者行IVF助孕。
受精16~18 h后出现双原核为正常受精, 胚胎培养至第3天(D3）, 分裂为7~9个细胞、细胞大小均匀、形态规则且碎片率 < 25%的胚胎为优质卵裂期胚胎。囊胚评分参照Gardner人类囊胚分级系统, 内细胞团和滋养外胚层细胞评分均为A或B的囊胚为优质囊胚, 其中一个评分为C的囊胚为非优质囊胚, 两者评分均为C的囊胚为不可利用囊胚。新鲜移植周期选取1~2个优质胚胎进行移植。
1.2.4 观察指标胚胎移植后14 d检测血β人绒毛膜促性腺激素是否为阳性, 阳性者28 d行B超检查, 检查到孕囊和心管搏动, 确定为临床妊娠。预产期前后随访胎儿出生相关情况。
1.3 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料用x±s表示, 组间比较采用单因素方差分析, 方差齐时组间两两比较采用LSD检验, 方差不齐时组间两两比较采用Dunnet t检验; 计数资料用率表示, 组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 不同DFI组精液常规参数的比较将683对不孕夫妇的男方按DFI值分为3组, 3组比较, NMSR无统计学差异(P > 0.05）。DFI > 30%组禁欲天数均明显高于DFI≤15%组、DFI > 15%~30%组(P < 0.05）, 即随着禁欲天数的增加, DFI值增大; DFI > 30%组精子浓度、PR均明显低于DFI≤15%组、DFI > 15%~30%组(P < 0.05）, 即DFI值越大, 精子浓度和PR越小。见表 1。
| Group | n | Abstinence duration (d) | Sperm concentration (×106/mL) | PR (%) | NSMR (%) |
| DFI ≤15% | 499 | 4.38±2.33 | 61.75±39.88 | 47.57±28.98 | 5.63±2.45 |
| DFI > 15%-30% | 153 | 5.18±3.67 | 52.64±38.57 | 33.24±18.50 | 5.48±5.39 |
| DFI > 30% | 31 | 10.57±8.121), 2) | 38.28±31.641), 2) | 25.34±20.711), 2) | 5.50±2.56 |
| PR, progressive motility; NSMR, normal sperm morphology rate. 1)P < 0.05 vs DFI ≤15% group; 2)P < 0.05 vs DFI 15%-≤30% group. | |||||
Spearman相关分析结果显示, DFI与精液检查禁欲天数呈正相关(r=0.150, P < 0.01）, 与精子浓度、PR呈负相关(分别为r=-0.135, r=-0.299, 均P < 0.01）。
2.2 不同DFI组妊娠结局比较将683对不孕夫妇的女方按DFI值分组, DFI≤ 15%组、DFI > 15%~30%组临床妊娠率和活产率均高于DFI > 30%组, 但差异无统计学意义(P > 0.05）。见表 2。
| Group | n | Clinical pregnancy rate [n(%)] | Live birth rate [n(%)] |
| DFI≤15% | 499 | 263 (52.7) | 204 (40.9) |
| DFI > 15%-30% | 153 | 82 (53.6) | 64 (41.8 ) |
| DFI > 30% | 31 | 11 (35.5) | 7 (22.6) |
2.3 IVF周期和ICSI周期精液常规参数的比较
IVF周期中, DFI≤15%组受精当日精子浓度显著高于DFI > 30%组(P < 0.05）, 随着DFI升高, PR有降低趋势, 但无统计学差异(P > 0.05）。ICSI周期中, DFI≤15%组受精当日精子浓度显著高于DFI > 15%~ 30%组、DFI > 30%组(P < 0.05）, DFI≤15%组受精当日PR显著高于DFI > 30%组(P < 0.05）。见表 3。
| Group | n | Sperm concentration on the day of fertilization (×106/mL) | PR on the day of fertilization (%) |
| IVF | |||
| DFI≤15% | 301 | 41.82±30.97 | 93.45±9.46 |
| DFI > 15%-30% | 59 | 34.37±22.00 | 92.53±5.27 |
| DFI > 30% | 7 | 18.14±12.901) | 92.29±3.25 |
| ICSI | |||
| DFI≤15% | 198 | 28.47±25.40 | 58.04±21.59 |
| DFI > 15%-30% | 94 | 16.99±14.071) | 51.29±24.75 |
| DFI > 30% | 24 | 8.19±7.541) | 35.96±26.231) |
| 1)P < 0.01 vs DFI≤15% group. | |||
2.4 IVF周期和ICSI周期妊娠结局的比较
IVF周期中, 3个DFI组比较, 临床妊娠率、活产率均无统计学差异(P > 0.05）; ICSI周期中, DFI > 30%组临床妊娠率、活产率均低于DFI≤15%组(P=0.048）、DFI > 15%~30%组(P < 0.05）, 差异均有统计学意义。见表 4。
| Group | n | Clinical pregnancy rate [n(%)] | Live birth rate [n(%)] |
| IVF | |||
| DFI≤15% | 301 | 167 (55.5) | 131 (43.5) |
| DFI > 15%-30% | 59 | 34 (57.6) | 27 (45.8) |
| DFI > 30% | 7 | 5 (71.4) | 3 (42.9) |
| ICSI | |||
| DFI≤15% | 198 | 96 (48.5) | 73 (36.9) |
| DFI > 15%-30% | 94 | 48 (51.1) | 37 (39.4) |
| DFI > 30% | 24 | 6 (25.0)1）, 2) | 4 (16.7)1）, 2) |
| 1)P < 0.05 vs DFI≤15% group; 2)P < 0.05 vs DFI > 15%-30% group. | |||
3 讨论
精子DNA携带父系遗传信息, 其完整性对成功妊娠和遗传物质传递至关重要。精子形成是多因素共同参与的过程, 受到男性自身状态、外界环境等因素干扰时可能产生碎片, 造成精子DNA永久损伤, 直接影响精子的正常功能[5]。本研究显示, 精子DFI与禁欲天数呈正相关, 而与精子浓度、PR呈负相关, 即随着禁欲天数的增加, 精子DFI升高, 精子浓度和PR下降。其原因可能是精子在附睾中储存时间越长, 精子细胞凋亡、氧化损伤越严重, 从而破坏精子核染色质的完整性, 导致精子质量下降[6]。这与已有的研究[7-9]结果一致。因此, 临床上可建议患者缩短禁欲天数, 降低DFI, 从而改善精液质量。
之前的研究[10]显示, 高DFI会降低IVF/ICSI周期妊娠率。然而最近的研究[11]表明, 精子DFI并不影响IVF或ICSI周期的妊娠率。本研究与SUN等[11]的研究结果相似, DFI≤15%组、DFI > 15%~30%组临床妊娠率和活产率均高于DFI > 30%组, 但差异无统计学意义(P > 0.05）, 这可能与高DFI患者样本量相对不足有关, 后续研究应进一步扩大样本量。
IVF和ICSI周期中, 随着DFI升高, 精子浓度和PR均下降。IVF周期中, 不同DFI组的临床妊娠率和活产率无统计学差异。但在ICSI周期中, DFI≤15%组、DFI > 15%~30%组临床妊娠率和活产率均显著高于DFI > 30%组(P < 0.05）。即DFI > 30%时, 妊娠率和活产率显著下降。2种受精方式的差别在于精液的处理过程, IVF周期将精液在37 ℃培养箱中上游至少15 min, 筛选出活力好的精子进行受精, 其过程可能更接近自然受精, 按照优胜劣汰的原则自动筛除掉高DFI的精子, 因此对妊娠率影响不大。研究[12]报道, 精液处理方法不同可能会影响精子DFI, 密度梯度离心优化后的精子DFI会显著下降。NIU等[13]的研究也证实, 在使用密度梯度离心优化处理后的精子进行IVF时, 精子DFI与妊娠结局无关。这表明适当的精子预处理会去除高DFI对卵母细胞受精和临床妊娠结局的不利影响, 与本研究结果一致。而ICSI周期由于没有优化处理精子, 所以DFI≥30%组的妊娠率和活产率明显低于DFI < 30%组。
近年来, 关于DFI能否预测辅助生殖助孕的临床结局, 一直存在较大争议。本研究发现, DFI升高, 精子质量下降, 在一定程度上反映DFI与常规精液分析指标密切相关, 可作为常规精液分析的有效补充。但对于DFI能否预测辅助生殖助孕结局, 本研究结果显示, 不同水平DFI与IVF/ICSI周期的妊娠率和活产率不完全相关, 造成妊娠结局的差异可能是精子优化处理过程, 也可能是卵母细胞本身的修复能力, 对轻微的DNA损伤自动启动修复程序[14-15]。
综上所述, 对高DFI的患者, 由于卵母细胞修复能力有限, 无法修复严重的精子DNA损伤, 不建议盲目选择并不会改善临床妊娠结局的ICSI方式助孕, 但可以尝试在缩短禁欲天数、优化精液处理过程的同时综合考虑精液检查结果和女方情况等, 确定最终助孕方案。
| [1] |
YANG HY, LI G, JIN HX, et al. The effect of sperm DNA fragmentation index on assisted reproductive technology outcomes and its relationship with semen parameters and lifestyle[J]. Transl Androl Urol, 2019, 8(4): 356-365. DOI:10.21037/tau.2019.06.22 |
| [2] |
李非凡, 杨昊, 肖佳云, 等. 精子DNA碎片指数与精液参数相关性的初步研究[J]. 中国男科学杂志, 2018, 32(1): 33-36. DOI:10.3969/j.issn.1008-0848.2018.01.007 |
| [3] |
GREEN KA, PATOUNAKIS G, DOUGHERTY MP, et al. Sperm DNA fragmentation on the day of fertilization is not associated with embryologic or clinical outcomes after IVF/ICSI[J]. J Assist Reprod Genet, 2020, 37(1): 71-76. DOI:10.1007/s10815-019-01632-5 |
| [4] |
TANG L, RAO M, YANG WJ, et al. Predictive value of the sperm DNA fragmentation index for low or failed IVF fertilization in men with mild-to-moderate asthenozoospermia[J]. J Gynecol Obstet Hum Reprod, 2021, 50(6): 101868. DOI:10.1016/j.jogoh.2020.101868 |
| [5] |
BARRATT CLR, AITKEN RJ, BJÖRNDAHL L, et al. Sperm DNA: organization, protection and vulnerability: from basic science to cli-nical applications: a position report[J]. Hum Reprod, 2010, 25(4): 824-838. DOI:10.1093/humrep/dep465 |
| [6] |
季兴哲, 杨杰, 宋娟, 等. 334例男性不育症患者精子DNA完整性与精液常规参数间的相关性分析[J]. 生殖医学杂志, 2017, 26(12): 1233-1237. DOI:10.3969/j.issn.1004-3845.2017.12.014 |
| [7] |
EVGENI E, LYMBEROPOULOS G, TOULOUPIDIS S, et al. Sperm nuclear DNA fragmentation and its association with semen quality in Greek men[J]. Andrologia, 2015, 47(10): 1166-1174. DOI:10.1111/and.12398 |
| [8] |
SAMPLASKI MK, DIMITROMANOLAKIS A, LO KC, et al. The relationship between sperm viability and DNA fragmentation rates[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2015, 13: 42. DOI:10.1186/s12958-015-0035-y |
| [9] |
熊旭升, 周竹君, 李雪燕, 等. 男性精子DNA碎片指数与精液参数的相关性分析[J]. 中国性科学, 2021, 30(8): 17-21. DOI:10.3969/j.issn.1672-1993.2021.08.006 |
| [10] |
ZHENG WW, SONG G, WANG QL, et al. Sperm DNA damage has a negative effect on early embryonic development following in vitro fertilization[J]. Asian J Androl, 2018, 20(1): 75-79. DOI:10.4103/aja.aja_19_17 |
| [11] |
SUN TC, ZHANG Y, LI HT, et al. Sperm DNA fragmentation index, as measured by sperm chromatin dispersion, might not predict assisted reproductive outcome[J]. Taiwan J Obstet Gynecol, 2018, 57(4): 493-498. DOI:10.1016/j.tjog.2018.06.003 |
| [12] |
XUE X, WANG WS, SHI JZ, et al. Efficacy of swim-up versus density gradient centrifugation in improving sperm deformity rate and DNA fragmentation index in semen samples from teratozoospermic patients[J]. J Assist Reprod Genet, 2014, 31(9): 1161-1166. DOI:10.1007/s10815-014-0287-z |
| [13] |
NIU ZH, SHI HJ, ZHANG HQ, et al. Sperm chromatin structure assay results after swim-up are related only to embryo quality but not to fertilization and pregnancy rates following IVF[J]. Asian J Androl, 2011, 13(6): 862-866. DOI:10.1038/aja.2011.77 |
| [14] |
PALINI S, STEFANI S, PRIMITERRA M, et al. Comparison of in vitro fertilization outcomes in ICSI cycles after human sperm preparation by density gradient centrifugation and direct micro swim-up without centrifugation[J]. JBRA Assist Reprod, 2017, 21(2): 89-93. DOI:10.5935/1518-0557.20170022 |
| [15] |
MESEGUER M, SANTISO R, GARRIDO N, et al. Effect of sperm DNA fragmentation on pregnancy outcome depends on oocyte qua-lity[J]. Fertil Steril, 2011, 95(1): 124-128. DOI:10.1016/j.fertnstert.2010.05.055 |