糖尿病是最常见的内分泌系统疾病^[1]。2020年数据显示，我国糖尿病发病率约为9.7%。糖尿病患者持续的血糖激活可诱发机体产生诸多病理性改变，并继发相关并发症^[2-3]。糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常见的并发症，严重可导致失明。近年来，常规西药联合中成药治疗DR的疗效逐渐得到证实。明目地黄丸基于六味地黄丸加味组成，全方共奏具益气养阴活血和补益肝肾之效^[4]。然而，明目地黄丸治疗DR的分子机制仍不明确。中药网络药理学是一门新兴学科，借助数学、计算机科学和网络科学等多学科方法，系统、科学、全面地探索药物治疗疾病的潜在分子机制^[5]。本研究拟采用网络药理学分析明目地黄丸的有效成分、作用靶点和通路等信息，并通过核心蛋白和药物有效成分的分子对接，从分子层面深入探讨明目地黄丸治疗DR的临床价值，亦为后续临床推广提供更多依据。

1 材料与方法 1.1 明目地黄丸成分检索

采用中药系统药理学分析平台（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）检索明目地黄丸组方中蒺藜、白芍、当归、菊花、枸杞子、泽泻、茯苓、山药、牡丹皮、山茱萸（制）、熟地黄的化学成分，筛选条件为类药性（drug-like，DL）≥0.18，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%。通过检索国内外文献查找石决明（煅）^[6]的主要化学成分，并通过BATMAN-TCM数据库进行化合物主要靶标蛋白检索。

1.2 基因芯片筛选

以“diabetic retinopathy”作为关键词，从基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO）下载DR患者人源基因芯片（GSE60436）。采用R语言（3.6.3）对所选取芯片数据进行标准化处理。

1.3 DR差异基因的筛选和处理

采用limma包依据差异基因的上调和下调倍数筛选差异基因，条件为P<0.05。并借助pheatmap包绘制差异基因表达的火山图。

1.4 明目地黄丸成分-靶点网络的构建

将DR相关靶点和组方中相关药物的主要预测靶点进行合并取交集。借助Cytoscape3.7.2软件进行靶点网络分析（分析采用“Network Analyzer”工具进行）。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建和关键靶点筛选

借助STRING平台（https://string-db.org/）构建明目地黄丸的潜在抗DR靶点及靶点的PPI网络图。参数设置为 > 0.9作为评分条件，蛋白种类选择“Homo sapiens”，并通过Cytoscape3.7.2软件的“Cytohubba”插件进行明目地黄丸抗DR核心靶点筛选。

1.6 基因本体（gene oncology，GO）及京都基因和基因组（kyoto encyclopedia of gene and genomes，KEGG）富集分析

借助R语言中的“ggplot2”“clusterProfiler”“enrichplot”和“org.Hs.eg.db”包对交集基因进行GO功能富集分析，并深入明确明目地黄丸中药活性成分的靶点蛋白在基因功能中的作用。再次使用上述R包进行KEGG功能富集分析，深入探讨明目地黄丸中药活性成分的靶点在通路中的作用。

1.7 明目地黄丸核心成分与关键靶基因的分子对接

从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载小分子Quercetin、luteolin、naringenin的结构式，再从PDB数据库（http://www.rcsb.org/）下载核心蛋白结构域的pdb格式，运行Vina脚本进行分子结合能计算以及分子对接结果展示，同时运行Discovery Studio 2019寻找对接位点并计算柔性结合的LibDockScore，若结合能<0说明配体与受体可自发结合，当Vina结合能≤-5.0 kcal·mol^-1以及LibDockScore能找到对接位点说明两者形成稳定对接，对配体-受体复合物进行分子对接结果3D、2D展示，以评价生物信息分析预测的可靠性^[7]。

1.8 体外实验

配制明目地黄丸溶液，并分为低剂量、中剂量和高剂量组。分别取4.5 g、9 g和13.5 g药丸溶于5 mL 75%乙醇，待完全溶解后置于离心管（母液），并放置于4 ℃冰箱保存。分别取500 μL母液加入500 μL完全培养基，均配制为1 mL/质量的溶液。

本研究采用高糖/低氧环境培养人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19模拟DR的代谢状态。模型建立方法：将细胞置于培养基中（含10%胎牛血清），待细胞融合达90%时，向培养基中加入氯化钴（终浓度调至100 μmol/L）和葡萄糖（终浓度调至25 μmol/L）。

采用Western blotting法检测PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达。采用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液提取细胞的总蛋白。然后，使用bicinchoninic acid protein assay kits试剂盒对蛋白质进行定量，用SDS-PAGE分离胶分析，转移到PVDF膜上，并用5%的脱脂牛奶封闭。4 ℃下用一抗孵育过夜，以GAPDH为内参，然后用相应的二抗孵育2 h，最后用增强化学发光试剂进行显影，采用Image J软件对实验结果进行分析。

1.9 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 DR相关差异基因表达分析

通过对GEO芯片数据库的基因芯片进行挖掘分析，获取DR患者和正常群体差异表达基因，见图 1。

2.2 明目地黄丸组方中药材主要化合物有效成分筛选结果

以DL≥0.18，OB≥30%为筛选条件，在TCMSP中检索蒺藜、白芍、当归、菊花、枸杞子、泽泻、茯苓、山药、牡丹皮、山茱萸（制）、熟地黄，并通过文献阅读明确石决明（煅）的主要化学成分，借助BATMAN-TCM进行标靶蛋白筛选，条件为：Score cutoff≥20，P<0.05，共筛选出39个化学物。

2.3 明目地黄丸有效成分-DR的网络构建及分析结果

将组方中261个靶点和9 945个DR差异表达基因取交集，得到160个交集基因。

2.4 明目地黄丸与DR相关标靶PPI网络（图 2）

利用STRING数据库将明目地黄丸160个DR相关构建标靶PPI网络，该网络共160个节点，173条相互作用关系，平均节点度值为5.15。将STRING平台中构建的PPI网络导入Cytoscape3.2.1中进行后续核心靶点筛选，借助CytoNCA插件，并以Network（NC）、LAC、Eigenvector（EC）、BC（betweenness）、DC（degree）和CC（closeness）作为打分标准进行核心靶点筛选，筛选标准为同时满足6项标准中大于中位值的基因。经过3次筛选最终得到核心靶点14个。

2.5 GO富集分析

以P值作为筛选条件选取了明目地黄丸和DR交集基因影响最大的前30个功能信息，见图 3。

2.6 KEGG富集分析（图 4）

利用KEGG富集对明目地黄丸和DR交集基因进行分析，选取影响最大的前30条通路。包括脂质和动脉粥样硬化、人类巨细胞病毒感染、PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎、化学致癌-受体激活、丙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、爱泼斯坦-巴尔病毒感染和癌症中的蛋白多糖通路，提示明目地黄丸通过以上多条通路发挥治疗DR的作用。

2.7 分子对接

分子对接结果显示，Quercetin、luteolin均与核心蛋白RB1形成稳定对接，其结合能远低于-5.0 kcal·mol^-1，naringenin与核心蛋白AKT1形成稳定对接，其结合能远低于-5.0 kcal·mol^-1。小分子Quercetin、luteolin、naringenin与核心蛋白RB1、AKT1的受体-配体进行柔性对接，结果显示DS能找到对接位点，且小分子naringenin与核心蛋白AKT1形成的对接模型LibDockScore均>100。核心蛋白RB1、AKT1与小分子Quercetin、luteolin、naringenin能形成稳定的对接模型，见表 1，图 5。

2.8 蛋白表达

Western blotting结果显示，高剂量组PI3K、Akt蛋白相对表达量显著高于中剂量组、低剂量组和空白对照组（F = 18.681，P<0.001），差异有统计学意义。见图 6。

3 讨论

中医认为糖尿病归于“眩晕”“心悸”“消渴”等范畴^[8]。治疗应以养肝、滋阴和明目为主。明目地黄丸方中白芍滋阴养血、柔肝；熟地黄益精填髓、补血滋阴；石决明（煅）明目去翳，平肝清热；蒺藜活血祛风、平肝解郁；山茱萸（制）涩精固脱、补益肝肾；当归补血活血；牡丹皮活血化瘀；菊花平肝明目、散风清热；山药补肾涩精、生津益肺；枸杞子益精明目、滋补肝肾；泽泻清湿热；茯苓健脾宁心。

本研究结果显示，MDM2、AKT1、RUNX2、JUN、HSP90AA1、CCND1、CDK4、CDK1、MYC、TP53、HIF1A、MAPK1、RB1和CDKN1A这14个基因为作用于疾病的核心基因。分子对接结果显示，槲皮素、木犀草素和柚皮素与RB1、AKT1具有较好的结合活性。动物实验研究^[9]证实，槲皮素可通过抑制视网膜新生血管的形成进而促进视网膜病变发生。CHAI等^[10]研究证实，槲皮素可抑制DR，其机制可能与抑制血红素加氧酶-1的表达有关。YANG等^[11]研究显示，木犀草素可通过调节NLRP/NOX4信号通路预防大鼠视网膜病变。AI-DOSARI等^[12]研究发现，视网膜组织的氧化应激反应激活是促进糖尿病患者眼底病变发生的重要机制，而柚皮素可通过抗凋亡、抗氧化和抗糖尿病等特性防止DR的发生。明目地黄丸方中存在多种药物活性成分可对DR治疗发挥积极作用，进一步分析明目地黄丸的KEGG信号通路，主要涉及病毒感染、炎症相关和内分泌系统。考虑内分泌系统紊乱是导致糖尿病发生和病情恶化的重要病理机制，而机体微炎症激活被证实是进一步导致眼部病变发生的重要因素。杨敏等^[13]报道，PI3K-Akt信号通路是治疗DR的重要靶点，且PI3K-Akt信号通路是“补肾活血法”治疗DR的重要靶点。基于KEGG通路富集分析和DR相关研究体外实验进展，本研究进一步选取高糖/低氧环境培养ARPE-19来模拟DR的代谢状态，并通过基于不同浓度明目地黄丸干预后，采用Western blotting法检测细胞中PI3K-Akt信号通路中p-PI3K和p-Akt蛋白的相对表达水平，结果显示，高剂量组p-PI3K和p-Akt蛋白相对表达水平显著低于中剂量、低剂量和空白对照组，中剂量显著低于低剂量和空白对照组，证实明目地黄丸可有效抑制ARPE-19细胞中PI3K-Akt信号通路的表达。

综上所述，本研究通过中医网络药理学方法深入探讨了明目地黄丸治疗DR的潜在分子机制，为临床治疗提供理论依据。