2022, Vol. 51文章信息
- 冷允俊, 刘晓蕊, 李琳, 王盈, 杨海元, 戴一凡
- LENG Yunjun, LIU Xiaorui, LI Lin, WANG Ying, YANG Haiyuan, DAI Yifan
- α-半乳糖苷酶A基因敲除猪胎儿成纤维细胞系的建立
- Construction of porcine fetal fibroblasts with GLA gene knockout
- 中国医科大学学报, 2022, 51(8): 688-694
- Journal of China Medical University, 2022, 51(8): 688-694
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文章历史
- 收稿日期：2021-06-23
- 网络出版时间：2022-07-13 15:39
引用本文 |
Fabry病，又称弥漫性血管角质瘤，是一种X连锁隐性遗传的溶酶体贮积病，致病基因为α-半乳糖苷酶A(α-galactosidase A，GLA)基因，位于Xq22.1，由7个外显子和6个内含子构成[1]。GLA基因编码α-Gal A，该酶位于溶酶体内，是一种同源二聚体蛋白，为神经酰胺三己糖苷(globotriaosylceramide，Gb3)分解代谢所必须。GLA基因的突变可引起α-Gal A功能部分或完全丧失，导致其代谢底物Gb3和相关鞘糖脂在人体的各器官、组织内积聚，造成多系统损害[2]。流行病学研究[3]显示，Fabry病的患病率为1︰117 000~1︰40 000，但这一患病率可能被低估，在一些国家的新生儿筛查中，患病率在1︰8 882~1︰1 368之间[4]。一项荷兰的队列研究[5]显示，受影响男性和女性的预期寿命的中位数分别为57岁和72岁。目前，Fabry病尚无治愈方法，主要采用人工重组α-Gal A治疗[6-7]。
目前，Fabry病的动物模型只有小鼠和大鼠，而小鼠和大鼠距离人类的亲缘关系较远，不能很好地复制Fabry病的病理过程。猪是除灵长类动物外与人类亲缘关系最近的物种之一，其解剖结构、生理生化指标、药物代谢和疾病发生发展等与人类十分相似。因此，猪是Fabry病模型的良好选择。建立人类Fabry病猪模型，有助于研究该病的病理过程，筛选药物和寻找特异性的生物标志等[8-9]。本研究通过生物信息学分析，比较了人/猪α-Gal A的相似性，并鉴别了猪α-Gal A的催化残基位置，为Fabry病猪模型的构建提供了理论支持；利用CRISPR/Cas9技术构建了GLA基因敲除的巴马公猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts，PFFs)，为构建Fabry病动物模型提供实验材料。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞35 d的巴马公猪PFFs为本实验室留存。
1.1.2 主要试剂与仪器pX330质粒(货号42230)购自美国Addgene公司；DH5α感受态细胞和质粒抽提试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；BbsⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶和T7E1酶均购自美国New England Biolabs公司；Basic NucleofectorTM Kits购自德国Lonza公司；DMEM培养液、G418药物、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青链霉素双抗和DPBS缓冲液均购自美国赛默飞世尔科技公司。单孔细胞核转染仪购自德国Lonza公司；生物安全柜购自美国赛默飞世尔科技公司。引物合成与DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.2 方法 1.2.1 人/猪α-Gal A的生物信息学分析在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载包括人和猪在内的16个物种的α-Gal A的氨基酸序列，采用MEGA X软件绘制系统进化树。采用DNAMAN软件对人和猪α-Gal A氨基酸序列进行比对，再用BLAST在线工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的Global Align程序计算二者的一致性和相似性。采用DNASTAR软件中的Protein模块，对人/猪α-Gal A进行二级结构分析，使用Chou-Fasman算法预测人/猪α-Gal A的α螺旋、β折叠、β转角的比例。使用Swiss Model在线工具(https://swissmodel.expasy.org/)对人/猪α-Gal A进行三维结构模拟，然后采用PyMOL软件比较两者三维结构的相似度，计算均方根偏差(root mean square displacement，RMSD)值。
1.2.2 猪α-Gal A催化残基的鉴别使用在线工具BLAST中的CD-search程序，寻找猪α-Gal A的结构域和催化残基。输入猪α-Gal A的氨基酸序列，数据库选择保守结构域数据库(conserved domain database，CDD)，为避免假阳性的出现，E值选择默认值0.01。
1.2.3 CRISPR/Cas9的靶点设计和打靶载体构建根据NCBI数据库中的GLA基因序列，针对第三外显子设计扩增引物(反向引物序列为CCTGCCTGGAG TGTTTTTCTC；正向引物序列为TACTGAGGAAAGC CAGGGATG)，进行PCR扩增测序，确定真实序列与数据库中GLA基因的差异。为确保酶完全失活，根据在线工具CRISPOR(http://crispor.tefor.net/)，在编码催化残基前的区域设计单链向导RNA(single guide RNA，sgRNA)，并设计Oligo合成(GLA_sgRNA反向引物序列为CACCGTTGATCTGCTCAAATTCGA，GLA_sgRNA正向引物序列为AAACTCGAATTTGAGCAGA TCAAC)。载体构建的步骤包括引物退火、载体酶切和连接。用去离子水将sgRNA Oligo稀释至100 µmol/L。反应体系包括正链Oligo 1 µL，负链Oligo 1 µL，去离子水8 µL。37℃ 30 min，95 ℃ 5 min，再以-5 ℃/min的速度降至25 ℃。用BbsⅠ限制性内切酶对pX330质粒进行线性化，连接退火产物，转化入DH5α感受态细胞。挑取单菌落，测序鉴定。对连接成功的菌株进行扩增，利用试剂盒提取质粒。
1.2.4 细胞转染与单克隆细胞的筛选在6 cm培养皿内复苏原代巴马猪PFFs(约2.6×106个)，用含16%胎牛血清的全培养基(42 mL DMEM培养液、8 mL胎牛血清和500 µL青链霉素双抗)，38.5 ℃、5% CO2的条件下培养约24 h，至细胞融合度达到90%以上。用0.05%胰酶消化2 min，1 200 r/min离心收集细胞。取5 µg打靶载体pX330-GLA和1 µg抗性质粒pHY54 SV40-neo，按照Lonza核转染试剂盒说明书转染细胞，程序为U-023。转染结束后，将细胞分盘至10 cm培养皿中，密度控制在4倍镜视野下细胞数约为30~40个。细胞培养24 h后，加1 mg/mL G418进行筛选。根据细胞状态降低药物浓度，药物筛选约9~12 d，四倍镜下观察细胞状态，单克隆长满1个四倍镜视野时，用记号笔在皿底圈出。DPBS清洗2遍，在标记处放置克隆环，加入0.25%胰蛋白酶，消化约2 min。无药全培养基终止消化，细胞悬液移至24孔板中，待细胞长满后，消化至12孔板中培养。留部分细胞在24孔板中继续培养，长满后消化并用NP40裂解细胞，提取基因组DNA用于PCR测序鉴定。
1.2.5 T7E1酶切法检测突变效率将转染后未分盘的细胞放入6 cm培养皿中，24 h后换药培养，待细胞长满后，消化提取基因组。PCR扩增并回收目的片段。T7E1酶切体系包括纯化产物200 ng，10×NEB Buffer 2 2 µL，去离子水补至19 µL。PCR仪中退火，95℃ 5 min，-2 ℃/s，降至85 ℃；-0.1 ℃/s，降至25 ℃；4 ℃保存。体系中加入1 µL T7E1酶，37 ℃孵育15 min。之后每管加入4 µL 6×loading buffer，2%琼脂糖凝胶电泳1.5 h。计算突变效率，InDel(%)=[1-(1-裂解产物占比)1/2]×100。
2 结果 2.1 人/猪α-Gal A的相似性用MEGA X软件绘制系统进化树，结果显示，与小鼠、大鼠和多种常见家畜相比，猪的进化距离与人更近(图 1)。二者的氨基酸序列一致性为81%，相似性为89%。使用Chou-Fasman算法预测的人/猪α-Gal A的二级结构比例结果显示，人α-Gal A的α螺旋占29.4%，β折叠占19.8%，β转角占35.4%；猪α-Gal A的α螺旋占28.9%，β折叠占21.5%，β转角占35.1%(图 2B)。二级结构的比例和排布十分相似，提示其三维结构也可能极其相似。采用Swiss Model在线工具对人/猪α-Gal A进行三维建模，再利用PyMOL软件比较两者三维结构的相似度，结果显示，RMSD值为0.012，亦说明其三维结构极其相似(图 2C)。通过生物信息学分析发现人/猪α-Gal A在结构上高度相似，推测猪α-Gal A的功能和特征也可能与人高度相似，还需在体水平进一步验证。
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| 图 1 不同物种α-Gal A的系统进化树 Fig.1 Phylogenetic tree of α-Gal A in different species |
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| A, amino acid sequence alignment of human/pig α-galactosidase A(the same amino acids are shaded in blue); B, secondary structure(red means α helix, green means β sheet, blue means β turn); C, three-dimensional structure(red means the structure of human α-galactosidase A, green means the structure of pig α-galactosidase A). 图 2 人/猪α-Gal A的一级、二级和三级结构分析 Fig.2 Analysis of α-galactosidase A primary, secondary, and three-dimensional structures between human and pig |
2.2 猪α-Gal A催化残基的鉴别
人α-Gal A的结构已被揭示，是一种同源二聚体蛋白，每个单体由2个结构域组成，分别是含有活性位点的一个(β/α)8桶状结构域和一个靠近C端含8条反向平行β折叠的结构域[10]。通过BLAST的CD-search程序查询，找到猪α-Gal A的结构域也有2个，分别是43~326位残基的含活性位点的结构域和靠近C端的329~415位残基的结构域(图 3A)。糖苷酶的催化机制是通过双重置换催化机制实现的，其中人α-Gal A的2次亲核攻击来自于第170位和第231位的天冬氨酸，对应于猪则是第174位和第235位的天冬氨酸(图 3B)[10-11]。
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| A, schematic diagram of domains and catalytic residues of pig α-galactosidase A; B, multiple sequence alignment of pig α-galactosidase A and CDD. 'Query' is pig α-galactosidase A. 图 3 猪α-Gal A的结构域和催化残基的鉴别 Fig.3 Identification of domains and catalytic residues of pig α-Gal xml: lang="en" |
2.3 CRISPR/Cas9打靶载体的构建
为确保猪GLA基因编码的α-Gal A完全失活，选择在编码第174位催化残基前的外显子区设计sgRNA[12]。测序结果如图 4所示，pX330载体中成功插入了猪GLA基因靶点的sgRNA序列。
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| A, schematic diagram of GLA gene target in Bama minature pigs; B, schematic diagram of pX330 vector; C, sequencing map of recombinant vector. Green means PAM sequence. The black line is the insertion sequence. 图 4 GLA基因靶点和重组载体测序 Fig.4 Target of GLA gene and sequencing of recombinant vectors |
2.4 GLA基因敲除细胞系的鉴定
经测序鉴定，共获得52个阳性单克隆细胞。图 5和表 1展示了5种突变型，均造成移码突变，导致编码催化残基的区域被破坏。
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| 图 5 GLA敲除PFFs的测序结果 Fig.5 Sequencing results of GLA-knockout PFFs |
| order number | Target site | Type |
| WT | …TTGCTGAGTGGGGAGTTGATCTGCTCAAATTCGATGGTTGTTACTGTGAC… | WT/0 |
| 1 | …TTGCTGAGTGGGGAGTTGATCTGCTCAAATT-GATGGTTGTTACTGTGAC… | -1 bp/0 |
| 2 | …TTGCTGAGTGGGGAGTTGATCTGCTCAAAT-CGATGGTTGTTACTGTGAC… | -1 bp/0 |
| 3 | …TTGCTGAGTGGGGAGTTGATCTGCTCAAATTACGATGTTGTTACTGTGAC… | +1 bp/0 |
| 4 | …TTGCTGAGTGGGGAGTTGATCTGCTCAAA--CGATGTTGTTACTGTGAC… | -2 bp/0 |
| 5 | …TTGCTGAGTGGGGAGTTGACG-------------TGGTTGTTACTGTGAC… | +2 bp，-15 bp/0 |
| WT，wild type；+，increase；-，decrease. The gray letters are the target sequences. The blue letters are the PAM sequences. The letters with yellow background are the sequences which encode the aspartic acid of 174th catalytic residue. Red letters are increased bases. | ||
2.5 T7E1酶切实验验证sgRNA的突变效率
PCR产物退火，再经过T7E1酶切后行凝胶电泳，结果显示目的片段被切成2段(图 6)。通过公式计算得出突变效率为17.17%。
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| M, 100 bp DNA ladder; C-1, wild type genome with T7E1 enzyme; C-2, GLA-modified genome with T7E1 enzyme; C-3, GLA-modified genome without T7E1 enzyme. 图 6 sgRNA突变效率的T7E1酶切验证 Fig.6 T7E1 cleavage assay of sgRNA mutation efficiency |
3 讨论
Fabry病是一种X连锁的溶酶体贮积病。目前，Fabry病的动物模型只有小鼠和大鼠，但其病理表现，如血管角质瘤、眼部和脑血管等并发症均表现不完全[13-15]。因此，开发一种更好的动物模型有助于深入研究Fabry病的病理机制和诊疗策略。猪的心血管系统、消化系统、皮肤、营养需要、骨骼发育及矿物质代谢等与人相似，体型大小与人接近，繁殖数量多，周期短，是极佳的模型动物[16]。猪模型不仅能很好地复制多种小鼠不能准确和全面体现的人类疾病，还能提供更好的后期实验或试药条件[17-18]。本实验室已制备了ApoE基因敲除猪，成功复制了动脉粥样硬化模型[19]。还实现了GGTA1、β4GalNT2和CMAH三基因敲除的猪，为异种移植提供了可能[20]。
由于GLA基因位于X染色体，本研究选择巴马公猪的细胞进行敲除，以避免杂合敲除的情况。本研究利用生物信息学方法对人/猪GLA基因编码的α-Gal A相似性进行分析，并鉴定出猪α-Gal A的催化残基位置。为确保酶完全失活，通过在线工具在猪α-Gal A编码催化残基前的外显子区制造移码突变，成功构建CRISPR/Cas9打靶载体，将打靶载体与抗性质粒共转染至巴马公猪胎儿PFFs，用G418药物筛选出单克隆细胞，并行PCR测序鉴定其基因型。结果显示，人/猪α-Gal A的氨基酸序列一致性为81%，相似性为89%；三维结构的RMSD值为0.012。猪α-Gal A的催化残基是第174位和第235位的天冬氨酸。
综上所述，本研究成功地构建了GLA基因敲除的巴马公猪PFFs，为后续体细胞核移植和胚胎移植提供了供体细胞，为构建人类Fabry病猪模型奠定了研究基础，为人类Fabry病的进一步探索提供了合适的动物模型。
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