喉癌是头颈部第二常见的恶性肿瘤，占头颈部肿瘤的13.9%，鳞状细胞癌是其主要病理类型。喉癌的具体病因尚不确定，可能与吸烟、饮酒等不良生活习惯以及病毒感染、环境、放射线等因素有关^[1]。喉癌治疗以手术方法为主，放疗、化疗和新型靶向治疗在临床中应用也较多^[2]。但即使在积极治疗后，晚期喉癌患者死亡率也极高^[3]。患者术后出现呼吸、发音以及进食困难，生活质量受到很大影响。肿瘤的形成和发展受多种生物分子的调控，如癌基因、肿瘤抑制基因和非编码RNA等，这是一个复杂的过程^[4-5]。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类无蛋白编码功能的RNA，其在表观遗传学修饰、转录调控、染色质修饰、转录后加工、核易位过程、细胞增殖和凋亡等多种生物过程中发挥重要作用^[6]。研究^[7]发现，lncRNA SLC25A25的反义RNA1（lncRNA SLC25A25-AS1）在结肠癌、宫颈癌、胃癌的发展中具有肿瘤抑制作用。本研究探讨了SLC25A25-AS1在喉癌细胞中的表达水平及其对细胞侵袭、迁移能力的影响，探讨其对肿瘤作用的分子机制。

1 材料与方法 1.1 材料

人鼻咽上皮细胞NP69和喉癌细胞TU-212、TU-177购自NTCC典型培养物保藏中心，喉癌细胞Hep-2购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，MTT试剂盒购自碧云天公司，RNA提取试剂TRIzol和脂质体Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司，实时荧光定量PCR引物购自南京金斯瑞公司，逆转录试剂盒和SYBR试剂盒购自北京Genstar公司，信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）抗体、磷酸化STAT3（p-STAT3）抗体和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗体购美国Proteintech公司，GAPDH多克隆抗体购自杭州贤至公司，HRP标记山羊抗兔IgG购自美国Thermo公司，BCA蛋白浓度检测试剂盒、SDS上样缓冲液和ECL发光液购自北京Genstar公司。

1.2 细胞培养和转染

NP69细胞置于Defined Keratinocyte SFM培养基中，TU-212和TU-177细胞置于RPMI 1640培养基中，Hep-2细胞置于EMEM培养基中。培养条件均为37℃、5%CO₂，常规换液。过表达组用脂质体Lipofectamine 3000将pcDNA3.1-SLC25A25-AS1转染至Hep-2细胞，NC组转染pcDNA3.1的空载体，对照组进行常规培养。48 h后检测SLC25A25-AS1表达水平。

1.3 总RNA提取和实时荧光定量PCR

转染48 h后，收集每组细胞，用TRIzol试剂提取细胞的总RNA，随后按逆转录试剂盒操作步骤将提取的RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR。反应条件：95 ℃ 30 s；95℃ 10 s，65 ℃ 10 s，30个循环。SLC25A25-AS1、STAT3和VEGF的表达以GAPDH为内参，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。引物序列：SLC25A25-AS1，上游5’-GTAATGAGCGTGCCGAGA-3’，下游5’-CCCGAGTGCTAATCAGACC-3’；STAT3，上游5’-GGGTCTGGCTGGACAAT-3’，下游5’-GCTTAGTGCTCAAGATGGC-3’；VEGF，上游5’-GGAACACCGACAAACCC-3’，下游5’-AATCCCCAAAGCACAGC-3’；GAPDH，上游5’-GCCAACGTGTCAGTGGTG-3’，下游5’-AAGGTGGAGGAGTGGGTGT-3’。

1.4 Western blotting检测蛋白水平

取转染48 h后的细胞，RIPA裂解液裂解后提取细胞总蛋白。随后用BCA蛋白浓度试剂盒检测各组总蛋白纯度，将蛋白提取液进行SDS-PAGE电泳，转膜封闭，滴加一抗（稀释度为1∶1 000）4 ℃过夜孵育，次日二抗（稀释度为1∶10 000），室温下孵育2 h，以GAPDH为内参，用ECL发光液显影，曝光显色后用ImageJ图像分析系统测量灰度值。目的条带灰度值/GAPDH条带灰度值为目标蛋白相对表达量。

1.5 MTT法检测细胞增殖活性

取对数生长期的对照组、NC组、过表达组Hep-2细胞，接种至96孔板，5×10³/孔，37 ℃、5%CO₂培养24、48、72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液，37 ℃、5%CO₂培养4 h。弃上清，加DMSO溶解MTT甲臜沉淀，测492 nm波长下的吸光度值，评估细胞活力。

1.6 划痕实验检测细胞迁移能力

将转染后的细胞悬液接种于6孔板，1×10⁵/孔，培养过夜，待细胞完全融合后开始划痕实验。用20 μL移液管尖端划伤细胞单层，细胞碎片用PBS冲洗，倒置显微镜下0和24 h时拍照并记录。

1.7 Transwell实验检测细胞侵袭能力

转染后的Hep-2细胞置于EP管中，制成1×10⁵/mL浓度的悬浮液，将细胞悬液加入Matrigel胶覆盖的Transwell小室上室，保证其均匀铺满小室底，室温过夜，下室加入15%胎牛血清的培养基，在恒温培养箱中培养24 h后，擦除小室内细胞，以甲醇固定，0.5%结晶紫染色，冲洗封片。

1.8 统计学分析

使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，两两比较采用t检验，多重比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 喉癌细胞的SLC25A25-AS1水平

与NP69细胞相比，TU-212、TU-177、Hep-2喉癌细胞的SLC25A25-AS1水平均显著下降（P < 0.05）。本研究后续实验选取SLC25A25-AS1水平最低的Hep-2细胞。过表达组Hep-2细胞的SLC25A25-AS1表达水平较对照组和NC组显著升高（P < 0.01），而对照组和NC组比较无统计学差异（P > 0.05）。见图 1。

2.2 过表达SLC25A25-AS1对Hep-2细胞增殖的影响

过表达组转染pcDNA3.1-SLC25A25-AS1载体48、72 h后，细胞增殖活性显著低于对照组和NC组（P < 0.05），而对照组和NC组比较无统计学差异（P > 0.05）。见图 2。

2.3 过表达SLC25A25-AS1对Hep-2细胞迁移的影响

划痕实验结果表明，过表达组Hep-2细胞的划痕愈合率（25.23%）低于对照组（85.64%）和NC组（81.25%）（P < 0.05），而对照组与NC组比较无统计学差异（P > 0.05）。见图 3。

2.4 过表达SLC25A25-AS1对Hep-2细胞侵袭的影响

Transwell实验结果显示，过表达组Hep-2细胞的穿膜细胞数低于对照组和NC组（P < 0.05），而对照组与NC组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 4。

2.5 过表达SLC25A25-AS1对Hep-2细胞中STAT3/VEGF通路的影响

与对照组和NC组相比，过表达组Hep-2细胞的STAT3水平无变化（P > 0.05），p-STAT3和VEGF水平降低（P < 0.05）；对照组和NC组比较，STAT3、p-STAT3和VEGF蛋白的表达水平均无统计学差异（P > 0.05）。见图 5。

3 讨论

非编码RNA是具有蛋白质功能的核酸分子，因缺乏完整的特异性开放阅读框，故无编码能力。根据核苷酸链长度分为两类，长度小于200 nt的为短链非编码RNA，长度大于200 nt的为lncRNA，lncRNA位于细胞核或细胞质内^[8]。一般来说，lncRNA RNA聚合酶Ⅱ转录后，再剪接加工就得到lncRNA。lncRNA依靠二级结构和剪接模式上的功能保守性，即使初级结构保守性差，仍具有组织或细胞特异性。随着生物科学研究的不断深入，lncRNA参与表观遗传、转录和转录后调控等多种生物学过程，扮演着信号分子、诱饵分子、向导分子、骨架分子的角色，具有调控肿瘤生物活性的作用^[9]。lncRNA可通过调控下游基因转录、干扰邻近基因表达、与编码蛋白基因的启动子区形成螺旋结构，阻断转录启动。此外，lncRNA可干扰mRNA的剪切，与微RNA等形成竞争性内源RNA，影响其靶基因的表达^[10]。

全世界每年约有新发喉癌患者13万例，且95.0%以上的患者为鳞状细胞癌，临床多表现为声嘶、呼吸困难、吞咽困难和颈部淋巴结转移等^[11]。HOTAIR、H19、MALAT1、NEAT1、SOX2-OT被证实在喉癌的发生、发展中发挥了重要的作用。本研究中的SLC25A25-AS1位于9q34.11，包含5个外显子，其转录方向与蛋白编码基因SLC25A25相反。SLC25A25是线粒体内膜的家族成员，参与线粒体载体蛋白的编码。LI等^[12]的研究证明，SLC25A25-AS1通过MAPK信号传导通路，参与结肠癌的恶性增殖和上皮间质转化。研究^[13]表明，SLC25A25-AS1过表达可以抑制宫颈癌细胞从上皮细胞向间充质的转化。目前，SLC25A25-AS1抑癌作用的研究集中在结肠癌、胃癌、宫颈癌，其在喉癌中的作用未见报道。本研究发现，SLC25A25-AS1在喉癌细胞中均表现为低表达，转染过表达质粒，可以抑制喉癌细胞增殖、侵袭、迁移。上述结果表明，SLC25A25-AS1与喉癌的发展密切相关，可能抑制癌细胞的侵袭和转移。

STAT3是STAT结合蛋白的一类，其作用广泛，参与许多生理功能调控^[14]。VEGF主要在血管内皮细胞、肿瘤细胞中表达^[15]。STAT3可以通过调节血管生成因子或缺氧诱导因子-1α等间接诱导VEGF的表达，而阻断VEGF的表达可以有效控制癌症的发生、发展。本研究发现，SLC25A25-AS1水平上调后，喉癌细胞中p-STAT3表达显著降低，同时VEGF的表达也减弱。由此得出，SLC25A25-AS1可能通过STAT3/VEGF信号对喉癌细胞的迁移和侵袭产生负调节作用。

综上所述，喉癌细胞中SLC25A25-AS1异常低表达可能通过抑制STAT3 /VEGF信号通路抑制喉癌细胞增殖、侵袭、迁移能力，发挥抑癌作用，这为喉癌发展和治疗提供了新思路。