有机磷中毒是临床常见的急危重症，具有发病快、病情变化迅速、死亡率高等特点^[1]。主要临床表现为乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）活性严重降低，毒蕈碱样、烟碱样症状及中枢神经系统等症状，以及各种原因诱导的全身多脏器功能损伤。临床上有机磷中毒采用复能剂、阿托品等对症治疗方案^[2]。

血必净注射液组方为红花、赤芍、川芎、丹参和当归，具有活血化瘀、扶正固本、清热解毒等功效，对全身炎症反应综合征、脓毒血症有一定的治疗作用^[3-4]。有研究^[5]表明血必净注射液能抑制有机磷中毒全身炎症反应、减轻心血管损伤、改善凝血功能等作用。血必净注射液与血液净化、复能剂等联合使用能够改善患者预后及减少并发症的发生^[6]。

目前，有机磷中毒重症患者仍缺乏有效及时的药物检测方法，难以准确调控“阿托品化”剂量。因此多种药物联合安全有效治疗有机磷中毒尤为重要。本研究基于网络药理学，对血必净注射液与有机磷中毒的复杂网络关系进行分析，探讨血必净注射液治疗有机磷中毒的分子机制，旨在为阐明血必净注射液治疗机制提供参考。

1 材料与方法 1.1 数据收集

以“红花”“川芎”“赤芍”“丹参”和“当归”五味中药材名称在TCMSP数据库（https://tcmspw.com/tcmsp.php）“Herbname”中进行检索，通过口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、类药性（drug-like，DL）对材料进行整理获得药物活性成分，通过TCMSP数据库收集的活性成分导入Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）中得到血必净注射液药物靶点的基因名称。以“organophosphorus pesticide poisoning”在GeneCards数据库（https://www.genecards.org）和OMIM数据库（https://www.omim.org）中检索，收集有机磷中毒基因靶点并整理。

1.2 方法

1.2.1 交集靶点获取

将血必净注射液药物活性成分靶点及有机磷中毒相关基因靶点导入在线工具Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），制作活性成分靶点和有机磷中毒靶点的韦恩图，获得其共同靶点基因，探究血必净注射液对有机磷中毒治疗的作用靶点。

1.2.2 活性成分-交集靶点网络构建

将血必净注射液药物活性成分、各类药物名称、相关靶点及有机磷中毒相关基因等导入Cytoscape3.7软件，构建活性成分-交集靶点网络，使用Cytoscape3.7软件中“Network Analyzer”计算连接度值，连接度值越高，表示其在网络图中的重要性越大，可能在疾病治疗中发挥的作用也越大。

1.2.3 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络制作

在String数据库（http://string-db.org）中导入药物和疾病的交集靶点基因，以“homosapiens”为检索物种，置信度≥0.4筛选数据，获得并导出PPI网络图，将String数据库检索数据导出，整理并筛选出重要蛋白。

1.2.4 交集靶点的富集分析

在DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）中将1.2.1获取的交集靶点基因导入并进行检索，进行基因本体（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，筛选整理排序前20位关系密切的相关富集分析结果，采用R-studio软件制作成柱状图。

2 结果 2.1 血必净注射液的活性成分

以OB≥30%和DL≥0.18筛选TCMSP数据库中血必净注射液药物活性成分，最后得到125个活性成分。OB值排序前15位（从高到低）的活性成分见表 1。

2.2 血必净注射液与有机磷中毒交集靶点构建

将血必净注射液活性成分导入Uniprot数据库获得靶点217个，从GeneCards、OMIM数据库检索有机磷中毒获得相关靶点279个，用Venny2.1绘制血必净注射液与有机磷中毒交集靶点，最终得到69个共同靶点，这些共同靶点可能为血必净注射液治疗有机磷中毒的潜在靶点。

2.3 活性成分-交集靶点网络图

在Cytoscape3.7软件中导入血必净注射液与有机磷中毒交集靶点关系，绘制活性成分-交集靶点的网络关系，见图 1。以连接度值大小排序，槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇位于前三位，分别为52、51、28，表明这3个活性成分可能是血必净注射液治疗有机磷中毒的重要核心药物活性成分。PTGS1、AR、ACHE为排名前三位的交集靶点基因，连接度值分别为42、27、27，表明这3个靶点基因可能是重要的治疗靶点基因，CHRM2、ESR1、OPRD1、PPARG、CASP3、SLC6A3等基因也有较大的连接度值。

2.4 PPI网络分析

将血必净注射液与有机磷中毒交集靶点导入String数据库中，获得交集蛋白相互作用关系，见图 2。通过导出String数据库数据，根据Betweenness Centrality、Closeness Centrality的均值筛选，结果显示AKT1、ALB、CAT、CASP3、JUN、VEGFA等靶点连接度值较大，这些靶点可能在治疗有机磷中毒中发挥重要作用。

2.5 交集靶点的富集分析

在DAVID数据库中导入交集靶点进行分析，如图 3所示，得到GO富集分析1 217个，KEGG代谢通路144条。生物过程（biological process，BP）1 122个，其中化学物质反应，氧化应激反应、活性氧反应、抗生素反应等富集程度较大；细胞组成（cellular component，CC）28个，其中脂筏、膜微结构域、囊腔、分泌颗粒内腔等富集程度较大；分子功能（molecular function，MF）67个，其中血红素结合、四吡咯结合、磷酸酶结合、氧化还原酶活性、DNA结合转录因子结合等富集程度较大。KEGG排名前20条通路见图 4，包括流体剪切应力和动脉粥样硬化、乙型肝炎、结肠直肠癌、膀胱癌、IL-17信号通路、前列腺癌、内分泌抵抗、糖尿病并发症年龄-年龄信号通路、卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染、细胞凋亡、胰腺癌、铂耐药、美洲锥虫病、丙型肝炎、人类巨细胞病毒感染、T细胞受体信号通路、麻疹、肿瘤坏死因子信号通路、弓形虫病、沙门氏菌感染等，血必净注射液可能通过这些通路起到治疗有机磷中毒的作用。

3 讨论

利用网络药理学对药物与疾病潜在的关系网络进行分析，能够促进药物的研发和疾病的治疗^[7]。本研究结果显示，有机磷中毒机制不限于对AChE的抑制，另一个重要机制是有机磷能诱导机体氧化损伤^[8-9]。机体产生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）造成脏器直接损伤，还可介导信号通路生成炎症介质，加重各器官损伤^[10-11]。经现代药理证实，血必净注射液具有改善微循环、抗炎、抗氧化、抑制炎症介质聚集与炎症反应等功效，有助于抑制血小板聚集、调节机体免疫反应和改善血管内皮功能^{[1, 12]}。

本研究发现血必净注射液治疗有机磷中毒的主要核心活性成分为槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇等。槲皮素可能通过多种途径减少氧化应激对细胞的损伤。卢春凤等^[13]发现槲皮素能减少氧化应激诱导的肝细胞损伤，可能与提高下游抗氧化基因的表达有关，从而抑制肝细胞凋亡。李冬梅等^[14]发现槲皮素通过下调心肌髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性和心肌NF-κB的表达，对心肌产生保护效果。BAO等^[15]用槲皮素处理H₂O₂诱导的大鼠嗜铬细胞瘤PC-12细胞，能提高细胞的生存能力，减少细胞和海马神经元的凋亡，说明槲皮素能减少PC-12细胞对氧化应激诱导的凋亡。

木犀草素是一种天然类黄酮化合物，结构中含有的酚羟基基团有较强的还原性，从而使木犀草素具有抗氧化特性^[16]。SEELINGER等^[17]发现木犀草素可减少诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的作用，降低iNOS的表达和一氧化氮（nitric oxide，NO）产生。研究^[18]发现木犀草素能够抑制多种白细胞介素（interleukin，IL）因子（IL-6等）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）等多种因子，增强IL-10的表达而发挥抗炎作用。

已有研究发现β-谷甾醇在抗氧化、抗炎、免疫调节等多个方面表现出良好的药理作用。VALERIO等^[19]认为β-谷甾醇可以提高脂多糖诱导的J774A1巨噬细胞抗炎因子IL-10的活性，下调趋化因子、促炎性细胞因子的表达，发挥抗炎作用。CHOI等^[20]认为β-谷甾醇减少NO合成，IL-1、肿瘤坏死因子等炎性细胞因子的分泌，抑制IL-6活性来发挥抗炎作用。

活性成分-交集靶点图与PPI网络图显示AKT1、ALB、CAT、CASP3、JUN、VEGFA等可能是血必净注射液治疗有机磷中毒的重要靶点蛋白，目前相关蛋白与血必净注射液、有机磷中毒的研究较少。KEGG通路分析提示血必净注射液治疗有机磷中毒相关通路涉及流体剪切应力和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、内分泌抵抗、细胞凋亡、T细胞受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等，这与现代药理证实的部分作用相符合^[1]，表明血必净注射液可能通过多通路、多信号对有机磷中毒产生积极影响。

综上所述，本研究基于网络药理学分析了血必净注射液与有机磷中毒的作用关系，从“多成分、多靶点”角度揭示了其可能的分子机制，认为血必净注射液可能通过作用于AKT1、ALB、CAT、CASP3、JUN、VEGFA等关键靶点基因，调控流体剪切应力和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等来发挥治疗效果。本研究结论是基于网络药理学原理，通过提取数据库信息整理、分析而获得，与实际作用机制可能存在差异，因此需要进一步实验来验证。