头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）是头颈部癌症中最常见的类型。其中，鼻咽癌居首位，统计显示2020年全球鼻咽癌发病13.3万余人，死亡达8万人^[1]。尽管鼻咽癌对放射治疗（简称放疗）相对敏感，但中晚期鼻咽癌放疗后局部复发和远处转移一直是治疗的难点。因此，寻找新的鼻咽癌治疗方法迫在眉睫。

细胞焦亡是一种新的程序性细胞死亡方式，以细胞膜孔形成、细胞肿胀、细胞溶解和炎性细胞因子释放著称^[2]，是宿主抵御感染和危险信号的关键，近年来已成为肿瘤领域研究热点。cyclin B1是细胞周期G₂/M期的关键检查点蛋白，参与有丝分裂过程中染色体凝聚、核膜破裂和纺锤体组装等过程^[3]，在胃癌^[4]、肺癌^[5]、食管癌^[6]等多种肿瘤中高表达，且与肿瘤恶性表型相关。研究^[7]显示，cyclin B1高表达的HNSC患者放疗后局部复发或淋巴结转移风险高于低表达患者，提示cyclin B1高表达可能与HNSC放疗抵抗相关，因此，cyclin B1可能是颇具潜力的肿瘤治疗新靶点。本研究组前期研究^[8]显示，敲低cyclin B1可抑制Hela细胞的生长并诱导细胞产生凋亡。此外，靶向敲低鼻咽癌细胞cyclin B1表达可诱导细胞自噬^[9]。cyclin B1与细胞焦亡的相关性目前尚未见报道。因此，本研究拟探讨下调cyclin B1对HNSC细胞焦亡的影响，旨在发现HNSC治疗的新靶点和拓宽治疗思路。

1 材料与方法 1.1 数据来源

cyclin B1在HNSC与正常组织的差异表达分析数据来自GEO^[10]及UALCAN数据库^[11]；cyclin B1的免疫组化数据源于Human Protein Atlas（HPA）数据库^[12]；cyclin B1与HNSC的生存分析数据源于GEPIA数据库^[13]；细胞焦亡基因及cyclin B1的表达谱数据来源于OncoLnc数据库^[14]。

1.2 实验材料及方法

1.2.1 主要试剂和仪器

人鼻咽癌细胞株CNE-2由福建医科大学附属第一医院中心实验室馈赠。人鼻咽癌细胞株HONE-1购自上海中亚生物公司。cyclin B1及阴性对照（negative control，NC）的siRNA购自广州市锐博生物科技有限公司。GP-transfect-mate购自中国GenePharma公司。cyclin B1抗体（ab23053）、GSDMD抗体（ab215203）、GSDME抗体（ab215191）、caspase 1（CASP1）抗体（ab207802）、caspase 3（CASP3）抗体（ab32351）购自英国Abcam公司。内参β-actin抗体（AF7018）、GAPDH抗体（AF7021）购自美国Affinity公司。凝胶成像仪（Biosciences AccuriC6型）购自美国Bio-Rad公司，相差显微镜（IX50/70型）购自日本Olympus公司。

1.2.2 细胞培养

用含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素1 000 U/mL、链霉素0.1 mg/mL）的RPMI1640培养基，于37 ℃、5%CO₂恒温培养人鼻咽癌CNE-2、HONE-1细胞。

1.2.3 细胞转染

取对数生长期细胞（1.5×10⁵/孔）接种于6孔板，加入无抗完全培养基，融合度为40%时进行转染。以OPTI-MEM分别稀释siRNA和GP-transfect-mate，室温静置5 min，混匀形成转染复合物，室温下再静置20 min后加入至细胞培养基（siRNA终浓度100 nmol/L，GP-transfect-mate按照试剂说明书使用），转染后4~6 h更换为新培养基。cyclin B1-siRNA序列：正义为5’-CCAUGUUUAUUGCAAGCAATT-3’，反义为5’-UUGCUUGCAAUAAACAUGGTT-3’。NC-siRNA序列：正义为5’-UUCUCCGAACGUGUCA CGUTT-3’，反义为5’-ACGUGACACGUUCGGAG AATT-3’。

1.2.4 蛋白印迹检测

转染48 h后，按常规方法提取细胞总蛋白。上样量为每泳道20 μg，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜（0.45 μm PVDF膜），室温封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜，TBST洗膜，室温孵育二抗1h，TBST洗脱，ECL化学发光显影。导出照片后用Adobe Photoshop软件读取各条带灰度值。

1.2.5 高通量全转录本基因芯片检测

将已验证cyclin B1敲低及对照组CNE-2细胞样本送上海市吉凯基因有限公司，进行Clariom D全转录本基因芯片检测，根据检测结果筛选差异表达基因。

1.2.6 相差显微镜检测细胞焦亡形态

细胞转染后48 h置于相差显微镜下，于亮场下观察细胞形态，并拍照记录。

1.2.7 ELISA检测

细胞转染后24 h更换为无血清RPMI1640培养基，再过24 h收集细胞培养上清液，于4 ℃、3 000 r/min离心20 min，取上清按照人白细胞介素（interlukin，IL）-1β Elisa kit（JL13662，江莱生物公司）操作说明书进行检测。

1.3 统计学分析

利用GraphPad Prism 8进行统计分析，各组间结果比较用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。各基因集交集韦恩图通过EVenn在线可视化工具（http://www.ehbio.com/test/venn/#/）^[15]实现。

2 结果 2.1 cyclin B1表达及其与临床特征的关系

GSE12452数据集（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE12452）（图 1A）、GSE13601数据集（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE13601）（图 1B）及UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu）分析（图 1C）显示，HNSC组织cyclin B1的表达水平分别高于正常组织的4.35倍（P < 0.000 1）、5.26倍（P < 0.000 1）及2.42倍（P < 0.000 1）。HPA数据库^[12]（https://www.proteinatlas.org/ENSG00000134057-CyclinB1/pathology/head+and+neck+cancer）分析显示，cyclin B1在头颈正常组织中低表达，而在HNSC组织呈中等强度表达（图 1D、1F），提示cyclin B1在HNSC中蛋白及mRNA水平均为过表达。UALCAN数据库^[11]进一步分析显示，cyclin B1表达水平与HNSC组织分级、肿瘤分期显著相关，组织分级越高，其表达水平越高（图 2A），在2、3期患者中表达水平最高（图 2B）。

2.2 cyclin B1表达水平与HNSC的预后显著相关

GEPIA数据库^[13]（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php）分析提示，HNSC患者中cyclin B1高表达组（以中位数为分界）的无病生存期（disease free survival，DFS）短于低表达组（HR = 1.4，P = 0.043）（图 3）。

2.3 cyclin B1与细胞焦亡基因的相关性分析

33个细胞焦亡相关基因、GEPIA数据库^[13]及GSE13601数据集筛选差异表达基因取交集结果显示，GEPIA数据库、GSE13601数据集分别筛选出6个（GSDMB，GSDMD，NLRP1，PLCG1，AIM2，IL1B）和4个（CASP1，CASP4，AIM2，IL1B）具有差异表达的细胞焦亡基因（图 4A、4B）。OncoLnc数据库^[14]获取496例HNSC患者cyclin B1及33个细胞焦亡基因表达谱数据分析显示，27.27%（9/33）的细胞焦亡基因（AIM2，CASP6，GSDMD，NOD2，CASP8，GSDMA，SCAF11，GSDMB，CASP3）在cyclin B1高表达组与低表达组（以中位数为界）存在差异表达（图 4C），提示HNSC中cyclinB1的表达可能与细胞焦亡生物学过程相关。

2.4 cyclin B1与HNSC细胞焦亡的相关性

2.4.1 HONE-1、CNE-2细胞cyclin B1敲低效率检测

HONE-1、CNE-2细胞转染48 h后提取蛋白进行蛋白印迹检测，结果显示，cyclin B1敲低组（转染cyclin B1-siRNA，命名为KD组）的cyclin B1蛋白表达较对照组（转染NC-siRNA，命名为NC组）明显减弱，敲低效率分别为61.80%、85.99%（图 5A、5B）。

2.4.2 高通量基因芯片检测cyclin B1敲低后差异表达基因

ClariomD全转录本基因芯片检测结果筛选出cyclin B1 KD组（n = 3）与NC组（n = 3）差异表达的基因1 480个，其中包括细胞焦亡关键基因CASP1（图 5C、5D）。

2.4.3 相差显微镜检测细胞焦亡形态

细胞焦亡在光镜下主要表现为细胞肿胀膨大、细胞膜表面可见气泡样突出物。CNE-2、HONE-1细胞分别转染cyclin B1 siRNA 48 h后于相差显微镜下观察，可见KD组具有焦亡形态的细胞显著多于NC组（图 6）。

2.4.4 蛋白印迹检测细胞焦亡关键蛋白

转染后48 h，提取蛋白行蛋白印迹实验检测细胞焦亡执行蛋白GSDMD、GSDME前体及裂解片段以及焦亡信号通路的关键分子CASP1、CASP3的前体及裂解片段，结果显示，2组均可检测到CASP1、CASP3裂解片段（图 7A、7B），与对照组相比，cyclin B1敲低组的GSDMD、GSDME裂解片断有增加的趋势（图 7C、7D）。

2.4.5 ELISA检测IL-1β

转染后48 h收集细胞培养液上清，通过ELISA检测IL-1β，结果显示，2组无统计学差异（P > 0.05），但cyclin B1敲低组的IL-1β水平有较对照组增多的趋势（图 8）。

3 讨论

cyclin B1在细胞周期G₂/M期转化过程中发挥关键作用，在多种癌组织中异常高表达，从而导致肿瘤细胞增殖失控^[3-6]。肿瘤是以细胞增殖、分化与细胞死亡平衡失调为特征的疾病，诱导肿瘤细胞死亡是目前各种抗肿瘤治疗的目的。本课题组前期研究^[8]显示，沉默cyclin B1可显著抑制Hela细胞生长并诱导细胞凋亡，而沉默鼻咽癌CNE-2细胞的cyclin B1表达可通过AMPK-ULK1通路触发自噬^[9]，提示其可能成为肿瘤治疗的潜在靶标。细胞死亡形式主要分为程序性和非程序性细胞死亡两大类。程序性细胞死亡一直是肿瘤领域的研究热点，主要包括细胞凋亡、自噬及焦亡。细胞焦亡作为最新被证实的程序性死亡方式之一，与细胞周期关键检查点分子cyclin B1的关系目前尚未见报道。因此，本研究探讨了cyclin B1对HNSC细胞焦亡的影响，有助于全面揭示cyclin B1在HNSC中发挥的生物学功能，为探讨cyclin B1能否成为肿瘤治疗靶点提供理论依据。本研究通过大数据分析发现cyclin B1在HNSC组织中显著高表达，且与HNSC组织分级和分期显著相关，提示cyclin B1在HNSC的发生、发展中起着重要作用。

细胞焦亡以Gasdermin家族蛋白N端裂解片段在细胞膜上形成1~2 nm孔隙，使膜失去完整性，进而释放出大量炎性细胞因子和炎性细胞内容物为特征^[2]。本研究结合GEO、TCGA等数据库分析发现8个细胞焦亡基因在HNSC与正常组织中存在差异表达，提示细胞焦亡可能在HNSC的发生、发展过程中发挥一定作用。此外，本研究还发现9个细胞焦亡相关基因与cyclin B1的表达水平存在相关性，提示cyclin B1表达可能参与HNSC细胞焦亡的生物学过程。据此，进一步以鼻咽癌细胞为研究对象，通过沉默CNE-2细胞的cyclin B1表达后进行转录组测序，结果显示cyclin B1沉默可显著增加细胞焦亡通路关键分子CASP1的表达，也进一步支持了cyclin B1与细胞焦亡存在相关性的结论。

细胞焦亡经典通路中，由NLRP3、NLRC4、AIM2、pyrin和NLRP1组装成的典型炎症小体负责CASP1前体的切割^[16-17]，而CASP1前体被处理后的裂解片段则可进一步处理GSDMD，使其释放出N端结构域发挥膜穿孔的功能^[18]，可触发焦亡及诱导炎性细胞因子（IL-1β、IL-18）的释放^[19-20]。另有研究^[21]显示，GSDME可被CASP3特异性剪切生成GSDME-N端片段诱导细胞焦亡。本研究通过RNA干扰技术沉默HONE-1、CNE-2细胞cyclin B1后，相差显微镜下观察到cyclin B1敲低组具有焦亡形态的细胞显著多于对照组，ELISA检测结果显示cyclin B1敲低组细胞释放的IL-1β较对照组升高，蛋白印迹结果显示2组均可见CASP1、CASP3裂解片段，与对照组相比，cyclin B1敲低组的细胞焦亡执行蛋白GSDMD-N端片段及GSDME-N端片段有增加的趋势，但2组无统计学差异，因此，cyclin B1参与细胞焦亡生物学过程是否通过经典通路CASP1/GSDMD及CASP3/GSDME途径实现仍无定论。

综上所述，本研究结果显示，cyclin B1在HNSC组织中显著高表达，cyclin B1高表达与HNSC的不良分级、分期及DFS显著相关，且cyclin B1表达与细胞焦亡存在相关性，但其具体机制有待进一步探究。