梗阻性无精子症是由于输精管道梗阻使精子的运输发生障碍而导致精液中无精子的疾病。外科获取精子技术和卵胞质内单精子注射技术（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）的诞生和优化成熟，使梗阻性无精子症患者获得了拥有亲血缘关系后代的机会。形态选择性卵胞质内单精子注射（intracytoplasmic morphologically selected sperm injection，IMSI）是将活精子细胞器形态学检测和ICSI结合，在6 000倍以上的放大倍数下，无需染色，实时、高分辨地观察精子细微结构，挑选出精子头部空泡较少且各部分形态均正常的活动精子进行受精^[1]。研究^[2]显示，梗阻性无精子症患者行IMSI后，与传统ICSI相比受精率显著提高。本文总结了我科采用IMSI治疗1例梗阻性无精子症患者的疗效，并结合相关文献进行回顾分析。

1 材料与方法 1.1 临床资料

患者女，27岁，体质量指数19.5 kg/m²。14岁月经初潮，平素月经规律，周期26~30 d，7 d经净，量中、色红、质可，无痛经。2017年与丈夫同居，性生活正常（1~2次/周），未避孕。2018年10月于外院就诊，基础内分泌检查示卵泡刺激素10.50 mmol/L，黄体生成素3.73 mmol/L，雌二醇55.00 mmol/L，孕酮0.34 mmol/L，催乳素13.33 ng/mL，睾酮0.83 ng/mL，抗米勒管激素5.35 ng/mL。经阴道超声检查示双侧卵巢各可见5~7枚窦卵泡，子宫、附件无明显异常。甲状腺功能正常，免疫检查正常（抗核抗体谱、抗心磷脂抗体两项、抗卵巢抗体、抗子宫内膜抗体均阴性），染色体正常。诊断为原发性不孕症。

2018年男方于外院就诊，2次精液常规检查示精液中无精子，药物治疗无明显改善，否认外伤手术和生殖器官疾病史，附睾、输精管、精索静脉无明显病变，男性第二性征正常。性激素、染色体未见异常，精浆果糖阴性，葡萄糖甘酶明显偏低，睾丸穿刺见成熟精子。诊断为原发性不育症，梗阻性无精子症。

2018年底于外院行辅助生殖技术助孕，取卵6枚，行经皮附睾穿刺取精结合卵胞质内单精子注射（percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection，PESA-ICSI）受精，形成3枚可移植胚胎，其中2枚第3天（D3）卵裂期胚胎，1枚第5天（D5）卵裂期胚胎。先后分2次移植，均未孕，无剩余胚胎。

2020年5月于我院生殖中心就诊，要求助孕治疗。2020年7月于我院行第一周期取卵，拮抗剂方案。月经第2天普丽康（荷兰Organon公司）200 IU加注射用尿促性素（中国上海丽珠）75 IU启动促排卵，第7天开始加用思则凯（瑞士Merck Serono有限公司）0.25 mg/d至艾泽（瑞士Merck Serono有限公司）250 μg扳机日（包括扳机日）。促性腺激素（gonadotropin，Gn）用量2 400 IU，使用时间9 d，卵泡数14个，扳机日雌二醇3 110 pg/mL，黄体生成素1.48 mIU/mL，孕酮0.78 ng/mL，于2020年11月18日获卵11枚。女方未见明显异常，因“男方梗阻性无精子症，原发性不育症”行PESA-ICSI，正常受精6枚，形成3枚D3胚胎。新鲜胚胎移植2枚D3胚胎未孕，余1枚冻存。

2020年11月行第二周期取卵，因患者上个周期卵巢反应较好，本次仍使用拮抗剂方案。月经第2天果纳芬（瑞士Merck Serono有限公司）150 IU加贺美奇（德国Ferring GmbH制药有限公司）75 IU启动，第7天加用思则凯0.25 mg/d至艾泽250 μg扳机日（包括扳机日）。Gn用量2 400 IU，使用时间9 d，卵泡数15个，扳机日雌二醇 > 5 010 pg/mL，黄体生成素2.65 mIU/mL，孕酮1.04 ng/mL。于2020年7月16日获卵14枚。考虑到与附睾穿刺相比，睾丸穿刺对患者睾丸内生精小管功能的影响小，能够避免医源性附睾梗阻的发生^[3]，且2种方式ICSI在安全性和疗效方面无显著差异^[4]。为了取得更好的效果，本周期行经皮睾丸穿刺取精结合形态选择性卵胞质内单精子注射（testicular epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic morphologically selected sperm injection，TESA-IMSI）受精。

1.2 TESA-IMSI实验室方法

1.2.1 卵母细胞收集和处理

将获得的卵母细胞置于37 ℃、5% CO₂培养箱（Labotect C200，德国Labotect公司）培养4~6 h，放入含透明质酸酶（80 IU/mL，美国Irvine Scientific公司）的培养液中，脱去周围的颗粒细胞，选择成熟的卵母细胞培养备用。

1.2.2 精液收集和处理

常规消毒阴囊皮肤、铺无菌巾，注射2%利多卡因穿刺侧精索阻滞麻醉，用手固定睾丸，使用30 mL注射器沿睾丸横轴方向多个小角度反复进针3~4次，负压吸取少量睾丸组织，加入缓冲培养液（瑞典Vitrolife公司）中研磨，在400倍倒置显微镜（Nikon Ti-U，日本尼康株式会社）下仔细寻找精子，洗涤后获得睾丸精子。

1.2.3 显微操作

用缓冲培养液于玻璃底的平皿（353037，美国FALCON公司）中做数个5 μL液滴，在其中1个液滴中加入精子，无菌石蜡油（瑞典Vitrolife公司）覆盖。用精子放大系统于6 000倍显微镜（Nikon Ti2-U，日本尼康株式会社）下观察精子的外部形态以及精子头部有无空泡（图 1），挑选未见头部空泡且形态活动正常的精子，用显微操作仪NTX（日本Narishige公司）制动精子，行ICSI。

1.2.4 胚胎培养和质量评估

准备胚胎序贯培养液，卵裂期胚胎用G-1序贯培养液（瑞典Vitrolife公司），囊胚用G-2序贯培养液（瑞典Vitrolife公司），将显微注射后的卵子置入，在培养箱37 ℃、5%CO₂的条件下培养。注射16~20 h后于显微镜下观察受精情况，出现两原核为正常受精。只有质量良好的胚胎才能移植。本实验室质量良好的D3胚胎的特征是至少达到6细胞阶段且碎片率 < 20%。囊胚采用Gardner评分法^[5]评估胚胎质量。

2 结果

D3观察胚胎情况：正常受精9枚，可用胚胎9枚；取5枚胚胎培养囊胚，最终获得5枚胚胎（4枚D3胚胎，1枚D5胚胎），包括2枚优质D3胚胎和1枚囊胚（图 2）。

取卵后因患者雌二醇过高，为预防卵巢过度刺激综合征取消移植。2021年1月行冻融胚胎移植周期助孕，采用激素替代方案调整子宫内膜。因患者要求移植D3胚胎，本周期解冻移植2枚D3胚胎。获宫内单胎妊娠，2021年10月5日足月顺产一女孩，现健康状况良好。

3 讨论

梗阻性无精子症病因主要包括先天性双侧输精管缺如、输精管炎症导致阻塞、输精管结扎术后及腹股沟疝、隐睾手术误扎、误切输精管等^[6]。有些梗阻性无精子症患者可以通过手术疏通或重建输精管恢复生育力，有些因手术失败或者无法进行手术疏通的患者则选择辅助生殖技术助孕。

IMSI是一种非侵入性技术，可以在更高放大倍数（6 600~13 000倍）下对精子的顶体、顶体后致密层、颈部、线粒体、尾部和细胞核等6个细微亚细胞结构进行评价，挑选细微形态结构正常、头部无空泡、活力良好的精子进行显微注射，以获得更好的助孕结局。目前人们对IMSI的临床应用存在争议，有研究^[7-8]报道该技术对临床妊娠率和活产率无有利影响，而基于不同的不孕原因分类的研究^[9-12]结果表明，IMSI对临床结果有积极的影响。研究^[9]发现，当IMSI用于男性因素不育症和反复植入失败的患者时，受精率显著提高。研究^[10]显示，在对严谨的观察性研究进行的荟萃分析中，IMSI与ICSI相比，活产率升高，流产率降低。BALABAN等^[11]在一项前瞻性随机研究中发现，在未按不孕原因进行分类的不孕人群中，IMSI组的胚胎植入率、妊娠率和活产率都有上升的趋势，而在严重男性因素不育夫妇中（如男方梗阻性无精子症或严重少弱畸精子症），IMSI组的胚胎植入率显著高于ICSI组。研究^[13]显示，IMSI中正常细胞比例越高，妊娠率越高；而正常细胞比例较高的患者有足够的正常精子受精，因此在男方因素不占主导地位时，IMSI与ICSI相比并无显著差异。同时，尚无证据表明IMSI会增加先天性畸形的风险^[8]。HERSHKO-KLEMENT等^[14]的回顾性分析发现，IMSI不增加畸形率，并可能降低胎儿缺陷、出生缺陷和染色体异常率。

目前IMSI最相关的适应证仍有待确定，一般认为其适用于以下情况：（1）前次ICSI失败原因不明者；（2）试管婴儿治疗反复多次失败、无明显原因的反复流产者；（3）严重精子畸形患者（> 90%，传统评估方法）；（4）从睾丸或附睾取精患者；（5）多次流产且活精子细胞器形态学检测评估中精子头部空泡比例高者；（6）≥35岁的男性，以往无卵子因素的周期治疗失败者；（7）多次试管周期中没有或较少优质胚胎者（排除卵子因素）；（8）受精率低于25%或无受精患者^[15]。IMSI是国内新发展的技术，在我国进行相关临床试验的生殖中心较少，该技术更多用于实验研究中。因此，总结其适应证尚无大量数据和研究支撑，但不可否认其具有相当的临床价值，应进行进一步探索。

综上所述，IMSI可在更高倍数显微镜下选出形态和运动功能更好的精子，对于精液参数显著异常、反复ICSI失败的患者可显著提高胚胎受精率、临床妊娠率，并降低流产率。由于IMSI仪器价格比较昂贵、观察时间长、技术成本高、人员培训难度较大，尚未广泛推广。本例患者2个周期、多次移植未孕，最终通过IMSI成功妊娠，推测IMSI可作为梗阻性无精子症患者尝试助孕的有效方法。本例患者是单一案例，偶然性较大，目前已有多个国家开展IMSI研究，未来需更多的临床研究继续探讨IMSI的临床应用范围和价值。