肾小球微小病变（minimal change disease，MCD）是儿童中最常见的肾病综合征的病理类型，在成人肾病综合征中占10%~15%^[1]。尽管绝大多数的MCD对激素反应敏感，但难治性肾病的病例也不少见。由于需要长期应用激素和（或）免疫抑制剂控制病情，患者可能出现严重的不良反应，如感染、股骨头坏死等，并且少数患者治疗无效，肾功能进行性恶化，最终可能需要进行肾脏替代治疗，甚至死亡^[2]。因此，明确难治性MCD的病因和发病机制、寻找有效的治疗靶点、进行针对性治疗、提高肾病综合征的治愈率、减少复发率是有待解决的难题。

近年来，随着越来越多的激素抵抗性肾病（steroid-resistance nephrotic syndrome，SRNS）相关基因变异的发现，人们越来越关注遗传因素在难治性肾病中的作用^[3]。儿童和青少年中，SRNS相关基因变异最常见于局灶性节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulonephrosis，FSGS），而SRNS相关基因变异在难治性MCD患者中的研究很少。MCD多发于儿童，儿童时期是遗传性疾病的好发年龄；同时，MCD与FSGS有一定联系，有学者认为MCD与FSGS可能是同一种疾病的不同阶段^[4]。基于以上两点推测，遗传因素可能参与早年发病的难治性MCD的发病。因此，本研究选取30岁之前发病、病理类型表现为MCD的难治性肾病患者，采用高通量二代测序方法检测患者是否存在SRNS相关基因变异，初步探索遗传因素在难治性MCD发病中的作用。

1 材料与方法 1.1 研究对象

选取2017年1月至2018年6月中国医科大学附属盛京医院肾内科收治发病年龄 < 30岁、病理类型为MCD的难治性肾病患者7例。选取同期病理类型为FSGS的肾病患者2例（阳性对照）和年龄匹配的健康人3例。12例研究对象中，男11例，女1例。

入选患者均符合原发性肾病综合征诊断标准，MCD患者均为激素依赖或反复复发型肾病，符合难治性肾病的定义。排除继发性肾病综合征患者，包括狼疮性肾炎、乙型肝炎相关性肾病、紫癜性肾炎等；排除合并病毒性肝炎、原发性高血压、糖尿病、遗传性疾病、癫痫、血液系统疾病或恶性肿瘤患者。本研究获得中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准（2017PS012K），所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 标本收集与处理

留取研究对象外周EDTA抗凝静脉血5 mL，同样方法留取患者父母外周静脉血5 mL。采用NaI法提取外周血白细胞基因组DNA，-20 ℃保存备用。

1.3 基因检测

采用北京迈基诺公司提供的与遗传性肾小球病相关的74种基因组成目标基因penal，其中包括62个SRNS相关基因。利用高通量二代测序方法检测研究对象是否存在目标基因的变异，然后利用第一代Sanger基因测序技术对父母的基因进行验证，从而确定患者基因变异的来源。

74种基因包括ACTN4、MYO1E、COQ9、SLC35A2、ARHGDIA、PAX2、GLA、ZMPSTE24、ALG1、NEIL1、CRB2、SMARCAL1、B2M、PDSS1、INF2、LAMC2、ANLN、NEK8、CUBN、THSD7A、CD151、PDSS2、ITGA3、LMX1B、APOA1、NPHP3、DGKE、TRPC6、CD2AP、PEX1、ITGB4、COL4A4、APOE、NPHS1、EMP2、TSC2、CFH、PLA2R1、KANK1、APOL1、NPHS2、FAT1、UMOD、COL4A3、PLCE1、KANK2、ARHGAP24、NUP107、FGA、WDR73、COL4A4、PMM2、KANK4、COQ6、NUP205、FLG、WT1、COL4A5、PTPRO、LAMA3、COQ8A、NUP93、FN1、XPO5、COQ2、SCARB2、LAMB2、COQ8B、SLC17A5、LAMB3、LYZ、MEFV、MYH9、MME。

2 结果 2.1 研究对象的基本特征

本研究共纳入7例难治性MCD患者，2例初治的FSGS患者，3例健康人。同时收集到4例MCD患者父母的样本。7例MCD患者中，幼年发病（发病年龄 < 14周岁）3例，中位年龄25岁，均为男性；成人发病（发病年龄14~30周岁）4例，中位年龄26.5岁，均为男性。2例FSGS患者，中位年龄20岁，男1例，女1例。3例健康人，中位年龄26岁，均为男性。

2.2 基因检测结果

7例难治性MCD患者中发现1例SRNS相关基因变异，为成人发病的MCD患者（6号）。分析该患者样本，发现胞环蛋白肌动蛋白结合蛋白（ANLN）基因有1个杂合突变，遗传方式是常染色体显性遗传，经家系验证分析，变异来自患者母亲。该患者同时发生了地中海热（MEFV）基因纯合突变，经家系验证分析，其父母在该位点均为杂合突变，但这个基因不属于已知的SRNS相关基因。FSGS患者（8号）中也发现1例SRNS相关基因变异，是瞬时受体电位通道6（TRPC6）基因的1个杂合突变，遗传方式为常染色体显性遗传。健康人中未发现有意义的SRNS相关基因变异。见表 1。

在幼年发病的MCD患者中发现LAMB2（100%，3/3）和PLCE1（67.7%，2/3）杂合突变的发病率明显升高，而在成人发病的MCD患者和FSGS患者中未发现这2种基因突变。健康人中仅有1例LAMB2突变。这些基因突变的位点各不相同。

3 讨论

本研究利用高通量二代测序方法，对30岁之前发病的难治性MCD患者SRNS相关基因位点的变异情况进行了初步研究，在1例成人发病的MCD患者中发现了ANLN杂合突变，该患者同时发现MEFV纯合突变。在3例幼年发病的MCD患者中，发现了极高比例的LAMB2和PLCE1杂合突变，提示遗传因素可能参与难治性MCD的发病。但由于本研究纳入的病例数较少，需要纳入更多病例的研究证明这一结论。

ANLN编码的anillin是F-肌动蛋白结合蛋白，在肾脏的肾小管普遍表达，在肾小球表达很少，2014年首次在一个常染色体显性遗传的FSGS引起的肾病综合征家系中，确定了ANLN变异是引起家族性FSGS肾病综合征的病因。家族性FSGS肾病综合征中足细胞中anillin的表达增加。功能研究^[5]结果表明，anillin对于保持足细胞肌动蛋白细胞骨架的完整性发挥重要作用。进一步的研究^[6]显示，ANLN_R431C变异可以通过激活PI3K/AKT/mTOR/p70S6K/Rac1通路引起足细胞功能的多重紊乱，而钙调神经酶抑制剂可能部分通过抑制ANLN和mTOR发挥减少尿蛋白的作用。本研究在成人发病的MCD患者中也发现了该基因变异，患者为激素依赖性肾病，经过超长程的激素联合霉酚酸酯治疗，目前患者病情缓解。这例MCD患者中还发现了MEFV基因纯合突变。MEFV基因突变主要与家族性地中海热有关^[7]，但该患者并无发热、浆膜炎等自身炎症综合征的表现。有研究^[8]证实了家族性地中海热患者也可以合并其他类型的肾脏损害，如血管炎、紫癜性肾炎、急进性肾炎和原发性肾炎。土耳其学者发现，原发性肾小球肾炎合并MEFV变异的比率高达35.9%^[9]。MEFV的编码蛋白pyrin是固有免疫的一种重要的调节剂，它是组成炎症小体的重要成分，可以导致细胞焦亡，其中研究最多的是细胞质核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体^[10]。目前的研究^[11]发现，NLRP3的激活与足细胞损伤密切相关，参与多种肾脏疾病的发病，针对NLRP3及其组成成分的小分子抑制剂是很有前途的治疗剂。MEFV基因突变导致pyrin功能损害，从而导致炎症反应失控，是引起家族性地中海热的主要病因^[12]。这种过度的炎症反应很可能促进了免疫介导的足细胞损伤，产生蛋白尿。在另一例成人发病的MCD患者中发现了MEFV基因在同一位点的变异，对于这个变异位点编码蛋白的功能研究有助于进一步明确MEFV基因变异在难治性MCD发病中的作用。

先天性肾病综合征最常见的致病基因包括NPHS1、NPHS2、WT1、LAMB2和PLCE1^[13]。本研究在3例幼年发病的MCD患者中发现了极高比例的LAMB2和PLCE1杂合突变，与成人发病的MCD患者的基因变异明显不同。因此推断，多种先天性肾病综合征相关基因的微基因效应可能存在于幼年发病的难治性MCD患者中，未来研究需要纳入更多的病例证明这一点。

本研究在1例男性FSGS患者中发现TRPC6杂合突变，这是目前发现的成人发病的常染色体显性遗传SRNS相关的基因突变之一。TRPC6是足细胞裂孔膜的重要成分，其变异被认为与nephrin减少有关^[14]。目前共有31例伴有TRPC6变异的儿童或青少年发病的难治性肾病的病例报告，其中包括2例MCD患者^[15]。本研究在1例成人发病MCD患者中发现SRNS相关基因变异，在其余3例成人发病MCD患者和1例女性FSGS患者中也发现了1种及以上常染色体隐性遗传遗传的SRNS相关基因的杂合突变，但理论上必须是纯合基因突变才致病；更重要的是，在3例健康人中也发现多种常染色体隐性遗传SRNS相关基因的杂合突变，因此不能推断这些基因变异是与难治性肾病相关的致病性突变。

综上所述，本研究初步探讨了遗传因素是否参与了早年发病的难治性MCD的发病，并在7例患者中发现SRNS相关基因变异。但本研究存在不足之处：纳入的病例数少，未进行功能试验。目前还有新的SRNS相关基因被不断发现，因此通过进一步增加样本量、扩大检测范围及运用全基因组检测方法，可能会发现更多的基因变异，甚至是全新的基因。这有望揭示难治性MCD的发病机制，避免激素和免疫抑制剂的过度应用，同时可能为难治性MCD的治疗提供新的靶标。