作为死亡率极高的恶性肿瘤，胰腺癌在欧洲的致死率排名第四。我国胰腺癌致死率虽低于西方国家，但近年来发病率持续上升^[1-2]。研究^[3]表明，恶性肿瘤细胞的增殖与转移均和激活转录因子2（activated transcription factor 2，ATF2）有关，例如在小鼠模型中发现，ATF2能够通过激活细胞周期蛋白D1来参与雌二醇诱导的乳腺癌细胞增殖；B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）作为代表性的凋亡抑制分子，其启动子区域中的环磷酸腺苷反应元件可以与ATF2特异性结合来参与肿瘤细胞凋亡；在ATF2突变的小鼠中，调节凋亡基因GADD45α的表达也会降低^[4]。提示ATF2与恶性肿瘤细胞的增殖和凋亡过程相关。

目前关于胰腺癌细胞中ATF2的表达以及ATF2与胰腺癌细胞增殖和凋亡的关系仍缺乏研究。本研究拟通过检测胰腺癌与癌旁组织中ATF2的表达情况，对比ATF2 shRNA转染前后胰腺癌细胞株的增殖及凋亡情况，进一步探讨ATF2与胰腺癌发生的关系以及对胰腺癌细胞生物学行为的影响。

1 材料与方法 1.1 标本来源

胰腺癌及癌旁组织来源于中国医科大学附属第一医院2014至2016年手术治疗的胰腺癌患者，共14例配对标本，均经病理证实为胰腺导管细胞癌。癌旁组织取自距胰腺癌边缘1~2 cm处。所有患者已签署知情同意书，术前未接受放、化疗及免疫治疗。本研究获得中国医科大学医学伦理委员会批准。胰腺癌细胞株ASPC-1购自中国科学院上海细胞库，PANC-1购自上海中乔新舟生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分离、体外培养及ATF2 shRNA转染

参考已有胰腺细胞的分离方法^[5]，将胰腺组织碎块（1 mm³）在适量V型胶原酶（美国Sigma公司）中孵育，而后在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基（美国Hyclone公司）中进行传代培养，为后续RNA的提取做准备。

将ASPC-1及PANC-1细胞复苏放置于37 ℃温箱中（含5%的CO₂）进行细胞传代培养，并在24 h后进行ATF2 shRNA质粒和非特异性对照质粒（non-specific control，NC）的转染。ATF2 shRNA片段：5’-GGAGCCUUCUGUUGUAGAAUU-3’。ATF2 NC片段：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。

用含有10%胎牛血清的DMEM培养基筛选转染稳定的胰腺癌细胞株，并将ASPC-1组细胞（ASPC-1、ASPC-1-NC、ASPC-1-ATF2 shRNA）及PANC-1组细胞（PANC-1、PANC-1-NC、PANC-1-ATF2 shRNA）进行收集，用于后续实验。

1.2.2 细胞RNA提取、反转录及实时PCR检测

收集细胞并使用RNA提取试剂盒提取总RNA。以super M-MLV反转录酶进行反转录后，采用Exicycler^TM 96荧光定量仪（韩国BIONEER公司）对ATF2 mRNA水平进行荧光定量分析。β-actin作为内参基因，采用2^-ΔΔCt分析法计算胰腺癌及癌旁组织中ATF2 mRNA的表达。以同样方法检测ASPC-1及PANC-1组细胞中ATF2 mRNA表达水平，验证ATF2 shRNA的敲减效率。ATF2正向引物5’-TGGTAGCGGATTGGTTAGG-3’；ATF2反向引物5’-TTGGGTCTGTGGAGTTGG-3’；β-actin正向引物5’-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’；β-actin反向引物5’-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’。

1.2.3 Western blotting检测ATF2及p-ATF2蛋白表达

参考贺龙梅等^[6]的研究，以ATF2、P-ATF2，β-actin抗体为一抗（英国Abcam公司），羊抗兔IgG-HRP为二抗（中国碧云天公司）进行免疫反应。在发光、显影后观察p-ATF2、ATF2及内参β-actin蛋白的表达。以同样方法检测ASPC-1及PANC-1组细胞中ATF2蛋白表达水平，验证ATF2 shRNA敲减效率。

1.2.4 MTT实验测定胰腺癌细胞生长曲线

采用MTT法检测ASPC-1及PANC-1组细胞在4 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h的细胞活力。

1.2.5 胰腺癌细胞平板克隆实验

将ASPC-1及PANC-1组细胞培养至肉眼可见细胞克隆团，经多聚甲醛固定及瑞姬氏复合染料染色后，在显微镜下观察各组细胞。

1.2.6 胰腺癌细胞周期检测

培养ASPC-1及PANC-1组细胞，参照方法1.2.3，分别以Cyclin A和Cyclin D1抗体作为一抗，羊抗小鼠IgG-HRP作为二抗，采用Western blotting检测各组细胞中Cyclin A和Cyclin D1的表达水平。

1.2.7 胰腺癌细胞凋亡实验检测

培养ASPC-1及PANC-1组细胞，参照方法1.2.3，分别以cleaved caspase-3、cleaved PARP、Bax和Bcl-2抗体作为一抗，羊抗兔IgG-HRP作为二抗，采用Western blotting检测各组细胞中细胞凋亡相关蛋白表达水平。

1.3 统计学分析

采用Gel-Pro-Analyzer软件对Western blotting图像进行处理，分析目标条带光密度值。采用GraphPad软件进行统计学分析，绘制统计图，数据以x±s表示，组间差异采用独立样本t检验。实时PCR数值分析采用2^-ΔΔCt分析法。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 胰腺癌及癌旁组织中ATF2 mRNA的表达水平

采用紫外线分光光度计NANO2000（美国Thermo公司）分别检测胰腺癌及癌旁组织提取出的RNA。结果显示RNA纯度良好，可用于后续实验。实时PCR结果显示，胰腺癌组织中ATF2 mRNA的表达（0.001 3±0.000 4）高于癌旁组织（0.000 9±0.000 2），见图 1。

2.2 胰腺癌及癌旁组织中ATF2和p-ATF2蛋白的表达水平

以β-actin为内参，采用Western blotting检测胰腺癌及胰腺癌旁组织中ATF2和p-ATF2蛋白的表达水平（图 2A）。结果显示，胰腺癌组织中ATF2蛋白表达水平（0.50±0.03）较癌旁组织（0.25±0.02）显著上调（图 2B）；同时胰腺癌组织中p-ATF2的蛋白表达水平（0.71±0.04）与癌旁组织（0.40±0.03）相比也呈上调趋势（图 2C）。

2.3 ATF2 shRNA对胰腺癌细胞增殖的抑制作用

MTT检测结果显示，在转染24 h、48 h、72 h、96 h后ASPC-1-ATF2-shRNA及PANC-1-ATF2-shRNA组细胞增殖与对应NC组相比均显著抑制（P < 0.01）（图 3）。转染120 h后的ASPC-1-ATF2-shRNA组细胞仍受到抑制（P < 0.05）（图 3A），而120 h后PANC-1-ATF2-shRNA组细胞的增殖抑制效果更为显著（P < 0.001）（图 3B）。

2.4 ATF2 shRNA对胰腺癌细胞周期蛋白的抑制作用

以β-actin为内参，采用Western blotting检测Cyclin A及Cyclin D1蛋白表达水平。结果显示，ASPC-1-ATF-shRNA处理组中Cyclin A（0.67±0.02）及Cyclin D1蛋白表达量（0.53±0.01）与ASPC-1-NC组（1.07±0.03和1.03±0.03）相比均显著下降（P < 0.01）。同时PANC-1-ATF-shRNA处理组Cyclin A蛋白的表达量（0.63±0.02）与对应NC组（1.13±0.03）相比也显著下降（P < 0.01），见图 4。

2.5 ATF2 shRNA对胰腺癌细胞凋亡的促进作用

采用流式细胞术检测ATF2 shRNA对胰腺癌细胞凋亡的影响，结果显示，ATF2 shRNA PANC-1和ATF2 shRNA ASPC-1中细胞凋亡与NC组相比明显增多（P < 0.01，P < 0.001），见图 5。

以β-actin为内参，采用Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白，与NC组相比，ATF2 shRNA PANC-1、ATF2 shRNA ASPC-1中cleaved caspase-3、cleaved PARP表达量均上调2倍左右；而Bcl-2的表达量在ATF2 shRNA PANC-1中约下调5倍，见图 6。

3 讨论

胰腺癌相关诊断和治疗的准确性及有效性在近些年来有显著提升，但其5年生存率仍较低^[7]。虽然各种新型治疗方案有效地提高了胰腺癌术后患者的长期预后，但只有15%~20%的患者适合行手术治疗。因此，为了有效提高胰腺癌患者的生存时间和质量，缩短胰腺癌诊断时间，提高诊断的准确性刻不容缓^[8-10]。

转录因子是调节细胞基因表达的主导因子，通过与基因组靶点的精准结合影响转录^[11]。ATF2作为ATF/cAMP转录因子家族的成员之一，可促进与细胞周期、免疫、炎症反应及细胞凋亡相关的靶基因表达^[12]。ATF2已被证实可调节肿瘤上皮细胞的间质转化，参与细胞糖代谢和肿瘤发生，并且能够影响肿瘤细胞的侵袭性^[13]。但目前关于ATF2与胰腺癌相关性的研究还鲜有报道。本研究通过实时PCR及Western blotting检测发现，胰腺癌组织中ATF2的mRNA和蛋白的表达水平均高于癌旁组织，表明ATF2可能为胰腺癌的潜在标志基因，在未来的诊断上具有一定的应用价值。

恶性肿瘤具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、细胞凋亡受抑制等特性，关注以上特性是否随某基因表达量的改变而变化，可以进一步证明该基因对癌细胞产生的生物学行为^[14]。本研究采用基因沉默技术，构建了ATF2 shRNA表达载体并成功转染了胰腺癌细胞，通过流式细胞仪、Western blotting等检测发现ATF的沉默会改变细胞增殖、周期和凋亡等特性。细胞增殖速率变慢的同时，细胞周期相关蛋白Cyclin A和Cyclin D1的表达也显著降低，这与已有研究^[15]关于ATF2可通过调控Cyclin A来影响细胞增值的结论相一致。cleaved PARP为Caspase家族凋亡基因启动子，cleaved-caspase-3是程序性细胞死亡或凋亡的关键介质，2种蛋白表达增加时说明细胞凋亡增加^[16]。Bcl-2和Bax作为Bcl-2家族成员，前者具有抑制凋亡的作用，而Bax具有促进凋亡的作用^[17]。本研究结果显示，与对照组相比，cleaved caspase-3、cleaved PARP与Bax的蛋白表达水平上调，而Bcl-2的表达下调，这也进一步证实ATF2作为胰腺癌的致癌基因，对细胞凋亡及生长周期有重要影响。

综上所述，ATF2可作为胰腺癌疾病诊断的潜在标志物，也可作为后续治疗的靶标展开深入研究。同时，ATF2作为致癌基因的分子作用机制及其他临床意义有待进一步研究。