系统性硬化症（systemic sclerosis，SSc）是以皮肤和内脏纤维化、炎症和血管病变为特征的特发性全身性自身免疫性疾病，也是一种慢性炎性结缔组织疾病，累及皮肤、肌肉骨骼系统和多个内脏器官^[1-2]。我国SSc发病率和患病率居自身免疫性疾病的第三位，仅次于类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮^[3]。我国成年人SSc的年发病率较高，为（190~250）/100万^[4-5]。研究^[6]显示，SSc的整体发病率不高，但却有较高的病死率。目前，SSc的发病机制还未明确，因此给临床治疗带来了极大的困难。

微RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性小分子非编码RNA，由18~25个核苷酸组成^[7]。miRNA通过直接降解mRNA或阻断蛋白质的翻译过程调控基因表达，从而参与细胞增殖、分化、凋亡等许多生物学过程^[8-9]。miRNA通过靶向细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）或肌成纤维细胞增殖来增强或抑制纤维化^[10]。miRNA相对稳定，可在组织和体液中检测到，因此有希望成为监测疾病进程和治疗反应的生物标志物^[11]。研究^[12]发现miRNA-181b-5p、miRNA-223-3p以及miRNA-21-5p在SSc中的表达显著增加。WUTTGE等^[13]研究发现miR-20a-5p和miR-203a-3p可作为SSc相关的肺动脉高压发展的预测因子。bortolott等^[14]发现包括miRNA-409在内的特定miRNA可作为SSc诊断、进展评估和抗纤维化治疗的生物标志物，这些都说明miRNA在SSc诊断和治疗中具有极大潜力。本研究基于生物信息学分析构建SSc潜在的miRNA-mRNA调控网络，希望能够提供有前景的SSc诊断和治疗靶点。

1 材料与方法 1.1 miRNA数据集获取

搜索基因表达图谱（gene expression omnibus，GEO）数据库高通量基因表达数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），关键词选择“systemic sclerosis”或“scleroderma”；研究类型选择“array by non-coding RNA profiles”；种族选择“home sapiens”，筛选SSc血浆相关miRNA数据集，见表 1。选取GSE81293数据集进行后续分析。

1.2 差异表达miRNA（differential expression miRNA，DEM）筛选、DEM靶基因获取和靶基因上游转录因子的分析

GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）是基于R语言的网络应用程序，可用于筛选SSc患者和正常健康者之间的DEM。采用Benjamini和Hochberg方法调整P值，纠正假阳性结果的发生，将调整后的P < 0.05和|log FC | > 1设置为阈值。利用TBtools工具包在样本中筛选出DEM。利用MiRNet（https://www.mirnet.ca/）获取DEM的潜在靶基因。利用FunRich（https://www.funrich.org/）分析靶基因的潜在上游转录因子，P < 0.05为差异有统计学意义。

1.3 靶基因基因本体（gene ontology，GO）和京都基因和基因组数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析

为研究DEM靶基因的生物学功能，利用DAVID在线注释、可视化和集成发现数据库（https://www.david.ncifcrf.gov/）进行GO和KEGG路径分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建以及核心（Hub）基因的筛选

利用STRING在线数据库（https://www.stringdb.org/）对DEM的靶基因进行PPI网络构建和分析，并在Cytoscape软件中进行可视化。利用Cytoscape的插件CytoHubba，通过几种拓扑算法，根据预先加载的PPI网络的特征对节点进行排序。采用最大Clique中心性（maximal clique centrality，MCC）方法，筛选出在PPI网络中排名前10位的Hub基因。

1.5 Hub基因表达的验证

从GEO数据库下载GSE146093数据集的表达矩阵及其GPL570注释文件，根据注释文件找到表达矩阵中相关的Hub基因，验证并分析Hub基因的表达。显著Hub基因需要满足2个条件：（1）上调DEM的靶基因显著下调或者下调的DEM的靶基因显著上调；（2）P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 DEM筛选结果

使用GEO在线工具对GSE81293数据集进行分析，该数据集包含15个SSc样本和5个正常对照样本，以调整后P < 0.05和|logFC| > 1为阈值。筛选得到26个DEM，其中上调有let-7e-5p、miR-455-3p，下调有miR-4459、miR-4507、miR-4417、miR-3687、miR-1246、miR-4668-5p、miR-4530、miR-4299、miR-4516、miR-663b、miR-762、miR-665、miR-4463、miR-4656、miR-3663-3p、miR-4505、miR-4440、miR-4685-5p、miR-4281、miR-149-5p、miR-4793-3p、miR-27a-5p、miR-1469、miR-4508。见表 2、图 1。

2.2 DEM靶基因的筛选结果

通过miRNet数据库共筛选出候选DEM的靶向基因5 450个，其中上调1 407个，下调4 043个。每个DEM的靶基因数量见表 3。

2.3 靶基因转录因子的分析

利用FunRich软件预测DEM靶基因的转录因子，结果显示，上调DEM的转录因子包括NFYA、SP4、NRF1、ELK1、SP1、YY1；下调DEM的转录因子包括CACO、KLF7、E2F1、YY1、MYC、SP1。见图 2。

2.4 靶基因GO和KEGG分析

生物过程（biological process，BP）分析显示，DEM靶基因主要富集在DNA转录及其调控、细胞分裂和细胞间黏附方面；细胞组分（cellular component，CC）分析显示，靶基因主要富集于细胞膜、细胞溶质、核质以及蛋白质磺酰化等方面；分子功能（molecular function，MF）分析表明，靶基因在多聚腺嘌呤核糖核苷酸、DNA结合、转录因子结合、钙黏蛋白结合参与细胞黏附等方面显著富集。KEGG通路分析显示，DEM靶基因显著富集于P53信号通路、癌症通路、FOXO信号通路、神经胶质瘤、RNA转运、乙型肝炎、转录失调等。见图 3、4。

2.5 PPI和DEM-Hub基因网络的构建

通过STRING数据库分别建立了上调和下调DEM靶基因的PPI网络。然后将上述的PPI网络上传到Cytoscape软件，并使用Cytohubba插件筛选Hub基因。上调和下调的前10位Hub基因见图 5。

为了更好地研究DEM在SSc中的分子机制，利用Cytoscape软件构建了DEM-Hub基因网络。结果显示，miR-455-3p与6个Hub基因（DDX55、RBM28、EBNA1BP2、IMP4、PWP2、RRP1B）相互作用；let-7e-5p与4个Hub基因（UTP15、RSL1D1、PDCD11、PES1）相互作用；miR-149-5p与6个Hub基因（DHX9、SRSF1、ILF3、HNRNPH1、MATR3、HNRNPA1）相互作用；mir-4440与PTBP1相互作用。

2.6 Hub基因表达的印证

根据DEM-Hub基因网络，利用GSE146093数据集，印证前6个上调DEM靶基因（PWP2、UTP15、PDCD11、RSL1D1、RRP1B、EBNA1BP2）和下调DEM靶基因（HNRNPA1、EIF4A3、SRSFI、HNRNPH1、PTBP1、DHX9）的表达水平。对于上调的DEM，只有UTP15的表达呈现下降状态，而PWP2、PDCD11、RRP1B、EBNA1BP2的表达则相反（图 6）。下调的DEM中，PTBP1的表达显著增加，HNRNPA1、DHX9的表达反而下降（图 7）。因此认为let-7e-5p-UTP15和miR-149-5p-PTBP1是SSc潜在的调控途径，见表 4。

3 讨论

随着微阵列技术的发展，对各种疾病进展中的数千种基因的变化有了更深的研究。本研究提取GSE81293数据集数据，识别和筛选SSc与正常人血浆的DEM。结果显示，共筛选出了2个上调的DEM（let-7e-5p、miR-455-3p）和24个下调的DEM（miR-4459、miR-4507、miR-4417、miR-3687、miR-1246、miR-4668-5p、miR-4530、miR-4299、miR-4516、miR-663b、miR-762、miR-665、miR-4463、miR-4656、miR-3663-3p、miR-4505、miR-4440、miR-4685-5p、miR-4281、miR-149-5p、miR-4793-3p、miR-27a-5p、miR-1469、miR-4508）。

研究^[15]表明，miRNA表达可以被转录因子调控，本研究预测了SSc与正常人血浆的DEM的上游转录因子。其中，上调DEM的转录因子主要是SP1、SP4和NFYA，下调DEM的转录因子是SP1和KLF7，而且SP1在上行调控和下行调控中均占比最高。SP1是重要的转录因子，有研究^[16-17]指出SP1可通过参与调控肿瘤细胞增殖相关转录因子FOXM1在卵巢癌中的表达，促进卵巢癌病情进展。KYPRIOTOU等^[18]发现SP1和SP4转录因子的相互作用可以促进SSc成纤维细胞中Ⅰ型胶原的表达。NFYA在多种癌症中的表达增加，与不良预后相关；并且在氧化固醇结合蛋白的基础转录中起着重要的作用，可以通过P53/SRE BF2 /NFYA信号通路来下调氧化固醇结合蛋白2的表达^[19]。KLF7是神经系统发育和脂肪形成的关键因子，JIANG等^[20]研究表明KLF7的表达可诱导内皮细胞的氧化应激、炎症和细胞凋亡。

GO和KEGG分析显示，DEM主要富集于DNA转录及其调控、细胞分裂和细胞间黏附方面以及P53信号通路、FOXO信号通路。P53可通过调控多种细胞免疫相关信号通路来参与机体的免疫应答^[21]，通过上调Toll样受体增加促炎性细胞因子的产生^[22]，P53功能失调与SSc患者的成纤维细胞中的细胞凋亡途径受损相关，可能导致SSc患者皮肤的慢性纤维化的发生^[23]。FOXO是介导细胞存活的经典通路，PI3K/Akt/FOXO的相互作用对机体的免疫功能产生影响，在机体细胞的增殖、凋亡等方面发挥重要作用^[24]。

通过构建DEM-Hub基因网络，本研究发现大多数Hub基因与miR-455-3p、let-7e-5p、miR-149-5p联系密切。在排名前12位的Hub基因中，只有UTP15、PTBP1的表达与GSE146093数据集一致，可能是样本的来源不同所致。MOUILLESSEAUX等^[25]发现UTP15的缺陷对细胞存活和血管系统的正常运行产生了影响，并且与P53信号通路联系密切，而GUI等^[26]研究结果显示let-7e-5p可通过激活JAK1/ STAT3通路抑制促炎性细胞因子表达。本研究验证过程中发现，作为上调let-7e-5p的靶基因UTP15在SSc中下调表达，因此let-7e-5p-UTP15有可能作为SSc潜在的调控途径。PTBP1在人类几乎所有的细胞类型中都有表达，并且介导多种细胞过程，包括神经元细胞的生长和分化以及免疫细胞的激活，其功能受多种分子调控，包括miRNA、长链非编码RNA和RNA结合蛋白^[27]。通过miR-4440-PTBP1途径调控PTBP1的表达从而抑制免疫细胞的激活，可能成为控制SSc发展的一种有效方法。

综上所述，基于GEO数据库和生物信息学分析，本研究构建了SSc血浆中潜在的miRNA-mRNA调控网络，发现了let-7e-5p-UTP15、miR-4440-PTBP1可作为SSc患者诊断和治疗的潜在生物标志物。本研究的不足之处：（1）仅研究了SSc与正常对照之间的miRNA和mRNA，在SSc的不同阶段结果可能会不同；（2）与生物标志物分析通常需要的样本量比较，本研究采用的数据集的样本量较小；（3）仅基于公共数据库预测miRNA-mRNA的相互作用结果存在局限性，还需进一步通过体内和体外实验验证。