微RNA（microRNA，miRNA）是真核细胞生物中广泛存在的RNA分子，通过与mRNA特异性结合，抑制相关基因的表达^[1]，其表达紊乱与肿瘤发病密切相关^[2]。miRNA既可作为多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）诊断和治疗的标志性因子^[3]，也可以通过干预增殖、自噬、凋亡等相关基因，影响MM的进程^[4-5]。miR-181家族在人体内广泛存在，主要包括miR-181a、miR-181b、miR-181c及miR-181d ^[6]。在白血病细胞模型中，miR-181a以周期蛋白p27Kip 1为靶点，抑制细胞分化和细胞周期停滞^[7]。miR-181a还能以ATG5为靶点，抑制血清饥饿诱导和雷帕霉素诱导的细胞自噬^[8]。miR-181a表达降低可导致线粒体功能障碍，线粒体膜电位降低^[9]，并可以通过干预Parkin对线粒体自噬起调控作用^[10]。本研究组在前期预实验中发现，干预MM细胞的线粒体自噬可以诱发其程序性死亡，本研究拟进一步探讨明确miR-181a对MM的干预作用。

1 材料与方法 1.1 材料

MM细胞株MM1S购自中国科学院细胞库，LipofectamineTM RNAiMAX及相关转染试剂购自美国Invitrogen公司；LC3 Ⅱ，LC3Ⅰ，Beclin-1，P62，cleaved-caspase-3，Bcl-2，Bax，Parkin单克隆抗体购自美国Affinity Biosciences公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡流式检测试剂盒购自美国BD公司；miRNA的PCR引物、miRNA抑制剂（miRNA inhibitor）由北京Invitrogen公司合成。Parkin siRNA购自锐博生物公司。miRNA实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测试剂盒All-in-One miRNA qRT-PCR购自美国GeneCopoeia公司，使用美国ABI公司的ABI 7500仪器进行qRT-PCR检测。

1.2 MM患者骨髓及细胞株中miR-181a表达水平的检测

抽取15例MM患者骨髓，作为MM组。抽取5例健康志愿者外周血，作为正常对照组。以上标本均使用免疫磁珠分选。所有样本的采集均获得患者知情同意及医院伦理委员会的批准。将MM细胞株设为MM1S组。根据操作说明书，TRIzol法提取2组细胞总RNA，逆转录获得cDNA。miR-181a引物序列为5’-TGTCAGGCAACCGTATTCACCGTGAGTGGTACT CAC-3’；Short-miR-181 a序列为5’-CGTCAGATGTCC GAGTAGAGGGGGAACGGCGAACATTCAACGCTGT CGGTGA-3’。按SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR试剂盒（TaKaRa RR716）说明书配制反应体系，经过94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，扩增45个循环。结果用比较阈值法定量分析，用2^-△△Ct法计算。

1.3 细胞分组及检测

1.3.1 细胞分组及转染

培养人MM细胞株MM1S细胞并传代，将处于对数生长期细胞接种至6孔板，37 ℃、5%CO2培养箱培养。根据Lipofectamine^®2000试剂盒说明书，分别用miR-181a inhibitor、对照siRNA转染细胞，设为miR-181a inhibitor组、miR-181a NC组。LV3-miR-181a inhibitor序列为5’-ACTCACCGACAG CGTTGAATGTT-3’。LV3-NC序列为5’-TTCTCCGA ACGTGTCACGT-3’。干扰Parkin以回复实验的操作为在转染miR-181a inhibitor后，培养10 h，使用Parkin siRNA转染细胞，设为Parkin组。各组转染后置于37 ℃、5%CO₂培养箱中常规培养，12 h后更换新鲜培养基，继续培养48 h后检测。

1.3.2 CCK-8法检测细胞活性

各组细胞离心，用PBS洗涤，调整细胞密度为2×10⁵/mL，将2×10³个细胞接种于96孔板内培养24 h，分别在24、48和72 h时，加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃、5%CO₂培养箱中再孵育2 h后上机检测，使用酶标仪在450 nm处检测吸光度，计算各组活性，实验重复3次。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡

根据AnnexinⅤ试剂盒说明书操作。各组细胞离心，PBS洗涤，调整细胞密度为1×10⁶/mL，将2×10⁵个细胞加入5 μL Anne- xinⅤ-EGFP混匀后，加入5 μL碘化丙啶，混匀。避光孵育10~15 min后，上机检测。统计Q4区数值，计算早期凋亡率，实验重复3次。

1.3.4 线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）检测

取2×10⁵细胞置于0.5 mL细胞培养液中，加入0.5 mL JC-1染色液，37 ℃培养15 min，4 ℃离心4 min，洗涤，重悬细胞，上流式细胞仪检测，通过分析2个通道的比例（红色Q2/绿色Q4）判断MMP水平。

1.3.5 细胞内线粒体形态及自噬小体的透射电子显微镜（简称电镜）观测

各组取2×10⁵个细胞离心沉淀，加入2.5%戊二醛溶液固定，经丙酮脱水、渗透、包埋固化、60~80 nm超薄切片、染色后，透射电镜下观察自噬泡。

1.3.6 miR-181a靶基因的生物信息学分析

通过Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_71/）在线预测的miR-181a所有潜在靶基因，将其输入在线功能聚类软件David（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）对所有基因功能分类，找到miR-181a的靶基因。

1.3.7 Western blotting检测自噬相关蛋白表达

各组细胞培养48 h后，收集5×105个细胞，提取总蛋白，蛋白定量，取40 μg蛋白行SDS-PAGE电泳，40 mA恒流条件下4 ℃转膜过夜。TBST洗膜，分别加入一抗4 ℃孵育过夜（LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62、cleaved-caspase-3、Bcl-2/Bax和Parkin抗体），再与HRP标记的二抗作用，ECL发光，采用灰度扫描系统测定软件（美国National Institutes of Health）分析目的蛋白条带。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析，多重比较采用Tukey检验方法。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组miR-181a的表达情况

结果显示，MM组与MM1S组miR-181a表达水平无统计学差异（P = 0.14），且均较正常对照组显著升高（P < 0.001），见图 1。

2.2 miR-181a inhibitor对MM1S细胞活性的影响

与对照组比较，转染miR-181a inhibitor后，MM1S细胞的活性在48 h时受到显著抑制（P = 0.008），见图 2A。提示miR-181a对维持MM细胞活性具有重要意义。

2.3 miR-181a对MMP的影响

应用JC-1荧光探针测定各组MMP，以观察线粒体途径早期细胞凋亡情况。结果表明，miR-181a inhibitor组MMP的水平（0.43±0.03）显著低于空白对照组（2.21±0.07）和miR-181a NC组（2.07±0.12）（P < 0.01），见图 2D。说明抑制miR-181a可以促进MM1S细胞的线粒体途径凋亡。

2.4 miR-181a靶基因的生物信息学分析

通过Targetscan在线预测及在线功能聚类软件David对所有基因功能分类，发现miR-181a的靶基因为Parkin，见图 3A。

2.5 miR-181a干预Parkin介导的线粒体自噬

Western blotting结果显示，与对照组比较，miR-181a inhibitor组cleaved-caspase-3表达上调（P < 0.001），提示该组细胞凋亡水平高；Bcl-2/Bax水平显著降低（P < 0.001），提示为线粒体途径凋亡；与对照组比较，miR-181a inhibitor组的自噬标志物LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平上调（P < 0.001），P62水平显著下降（P = 0.001），提示转染组自噬水平显著升高；miR-181a inhibitor组Parkin表达水平高于对照组（P < 0.001），Parkin siRNA组回复后表达水平与对照组差异显著（P = 0.003），提示抑制miR-181a的表达后，MM1S细胞线粒体自噬水平升高，见图 3B、3C。

2.6 电镜下观察自噬泡和线粒体结构

透射电镜下，对照组未见到明显自噬泡，线粒体的大小和形状基本正常，见图 3D。而miR-181a inhibitor组可以观察到线粒体结构破坏、嵴消失、正常线粒体数量减少，自噬泡增多，证明miR-181a可以抑制自噬，降低正常线粒体水平及功能，诱发细胞凋亡。见图 3E。

2.7 Parkin基因敲减对自噬与凋亡的影响

敲减Parkin以进行回复实验，结果显示，Parkin组细胞活性、凋亡水平（图 2A、2B）、MMP水平（图 2D）、Bcl-2/Bax水平及线粒体自噬相关标志物水平（图 3B）与对照组相仿，与miR-181a inhibitor组差异显著（P < 0.001）。提示抑制miR-181a后，MM1S线粒体自噬水平升高，而凋亡经由Parkin通路诱发。

3 讨论

miRNA对正常细胞及包括MM在内的多种肿瘤细胞自噬的调控涉及多个环节，包括起始、成核、成熟等^[11-14]。自噬可通过抑制内质网应激防止生成错误折叠蛋白，促进MM细胞的增殖；子叶烯A和长春新碱能通过干预MM细胞自噬而抑制其自我更新^[15-16]。线粒体是关乎所有细胞生命活动极其重要的细胞器，因此线粒体自噬维持线粒体的质量与数量对细胞稳态至关重要。而线粒体自噬异常、mTOR和ERK1/2磷酸化水平增高与MM自我更新及硼替佐米耐药有关^[17]。目前已知线粒体自噬的调控方式主要有2种，一种是Parkin依赖性的，即Parkin与线粒体外膜蛋白PINK1介导的线粒体自噬^[18]，另一种是非Parkin依赖性的，如Nix介导的线粒体自噬^[19]。Parkin对底物泛素化具有重要意义，能够触发选择性线粒体自噬^[20]，因此Parkin水平能在一定程度上反映线粒体自噬程度。而作为调控Parkin水平的miRNA，pre-miR-181a参与了包括肺癌^[21]和急、慢性白血病^[22-23]在内的多种肿瘤细胞线粒体内在途径，包括Bax寡聚化，MMP降低及凋亡蛋白caspase-9和caspase-3的水解；miR-181a也可直接调控某些靶基因的转录水平，并在疾病的发生发展中发挥重要作用^[24]。研究^[25]发现，miR-181a可通过下调人神经母细胞瘤SH-SYSY细胞E3泛素链接蛋白Parkin的表达，抑制线粒体自噬，并能提高线粒体解偶联剂诱导细胞凋亡的程度，进一步证实了miR-181a的靶基因及其具体作用机制。

既往研究^[26]证实，MM患者骨髓、外周血单个核细胞中miR-181a水平较正常人显著升高；在意义未明单克隆免疫球蛋白血症患者中，该miR-181a水平也可见升高^[10]，且与疾病的程度呈正相关，D-S分期Ⅲ患者水平明显高于Ⅰ+Ⅱ期患者^[27]。研究^[27-29]证实，miR-181a可通过干预包括NOVA1、HOXA1等多种基因影响MM细胞的增殖；动物体内实验证实，敲除miR-181a后，MM瘤负荷明显降低^[30]，以上结果均证实了miR-181a与MM发病的相关性。但目前少见关于miR-181a在MM细胞线粒体自噬中的研究。

本研究结果表明，在MM患者的骨髓及MM1S细胞株中，miR-181a表达水平均高于正常人，与其他研究^[27-28]结果一致。MM1S细胞株转染miR-181a inhibitor后，细胞活性明显下降。考虑到miR-181a是线粒体自噬抑制剂，因此进行了线粒体相关检测，结果发现，在miR-181a inhibitor作用下，MM1S细胞的MMP下降，而cleaved-caspase-3水平升高，Bcl-2/Bax水平明显降低。Bcl-2与Bax属于同一个家族，通过控制线粒体膜的通透性，调节凋亡激活物的释放，影响细胞的状态，Bcl-2表达水平升高和（或）Bax表达水平降低表示细胞对凋亡的抵抗性增强。本研究结果发现，抑制miR-181a后，Bcl-2水平下降明显，而Bax水平变化不显著，提示miR-181a inhibitor诱发了MM细胞的线粒体途径凋亡。进一步检测线粒体自噬指标发现，miR-181a inhibitor作用下，P62蛋白表达水平降低，LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ比值升高，且电镜证实细胞内自噬小体增加，而miR-181a的靶基因Parkin表达水平升高，提示抑制miR-181a可以通过调控Parkin通路干预线粒体自噬，从而促进MM细胞的凋亡。回复实验结果进一步显示，敲减Parkin后，miR-181a inhibitor降解靶基因Parkin的作用减弱，从而促进线粒体自噬及MM细胞凋亡。

综上所述，本研究发现抑制miRNA-181a可增强Parkin表达，促进其通路介导的线粒体自噬，从而促进MM细胞的凋亡。