Y染色体Yq11区无精子症因子(azoospermia factor，AZF) 是男性精子生成的决定性基因，2013年欧洲男科学会和欧洲分子遗传学质量网络联合制定的Y染色体微缺失诊断指南中，建议无精子症或精子浓度 < 2×10⁶/mL的严重少精子症患者行微缺失检测，并推荐三区的微缺失诊断，即AZFa、AZFb和AZFc，对应引物组sY84、sY86、sY127、sY134、sY254和sY255，该引物组可满足常规诊断。但临床实际工作中，各实验室开展的Y染色体微缺失检测位点却不尽相同，我院所行微缺失检测包括AZFa、AZFb、AZFc及AZFd 4个区域12个位点，本研究拟针对这些位点探讨男性不育患者Y染色体微缺失的种类及其与精子检测结果之间的关系。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 临床资料

对2018年1月1日至2019年12月31日期间于中国医科大学附属盛京医院就诊的3 720例男性不育患者(均来自于辽宁、吉林、黑龙江地区) 行AZF检测。纳入标准为精子浓度 < 5×10⁶/mL的严重少精子症或顽固型少弱精子症，药物治疗未见好转。采用真空采血管采集患者静脉全血2 mL (EDTA抗凝)。

1.1.2 试剂与仪器

Y染色体微缺失检测试剂盒由中国医科大学附属盛京医院遗传研究室专门定制提供。耐热DNA聚合酶(Taq酶，美国Life公司)；4种核苷酸单体(dNTPs，美国Life公司)；Roche LightCycler 480 Ⅱ (瑞士罗氏诊断公司)；ABI Prism 7500 (美国Life公司)；Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪(美国伯乐公司)。

1.2 方法

采用实时荧光PCR方法检测Y染色体微缺失。检测试剂盒由中国医科大学附属盛京医院遗传研究室专门定制提供，以Y染色体AZF区的12个基因位点(sY84、sY86、sY127、sY134、sY143、sY157、sY239、sY242、sY254、sY255、sY145、sY152) 为靶序列，设计特异性引物及荧光探针，采用PCR及荧光标记探针技术，对每个待检样本进行4个三重PCR反应，快速检测样本中Y染色体AZF区12个位点是否存在缺失。Y染色体AZF区域内的12个序列标签位点具体分类如下：AZFa区(sY84、sY86)，AZFb区(sY127、sY134、sY143)，AZFc区(sY157、sY239、sY242、sY254、sY255)，AZFd区(sY145、sY152)。

2 结果

本研究中，共有3 720例不育患者接受AZF微缺失检测，检测出Y染色体有微缺失者165例，检出率4.43%，符合欧洲指南的解读。我院检测的AZFa、AZFb、AZFc以及AZFd 4个区域共对应8种缺失模式：AZFabcd、AZFa、AZFb、AZFbcd、AZFbcd (部分b，即b只缺失1个位点sY143，其余位点存在)、AZFcd、AZFc (部分c) 和AZFd。AZF微缺失构成比：AZFabcd 5.45%，AZFa 5.45%，AZFb 6.67%，AZFbcd 16.98%，AZFc 60.00%，AZFd 5.45%。其中，AZFc部分或全部缺失及AZFd部分或全部缺失的患者最多，共108例，约占总缺失数的2/3，且这些患者中约2/3正常手淫取精检测即可见精子。见表 1。

精子数量分析结果显示，AZFc及AZFd是全部缺失还是部分缺失意义并不大，均可有精子的存在。AZFd缺失有精子者平均精子数量[(4.36±7.74) ×10⁶]高于AZFc缺失者[(16.79±20.94) ×10⁶]，因此，AZFd缺失对男性不育的影响相对更小。有精子存在的微缺失患者中，有1/10 (11/110) 是隐匿性无精子症患者，即常规检测未见精子，在精液离心后才找到极少量精子。见表 2。

3 讨论

Y染色体微缺失是仅次于Klinefelter综合征的男性不育第二位常见遗传病因。在过去的20余年中，Y染色体微缺失的分子诊断已成为男性不育症诊断中的一项重要检测内容。普通人群中，约有1/4 000的人发生Y染色体微缺失，但在不育男性中微缺失的频率显著增加^[1]。Y染色体从1对常染色体进化而来，积累了包括SRY和其他精子发生相关基因在内的雄性特异性基因。Y染色体的结构与常染色体不同，它由多个基因拷贝、DNA序列和单倍型多态性组成，在其进化过程中发生了许多基因重排。欧洲指南推荐的多重PCR反应中使用的PCR引物组是诊断AZFa、AZFb和AZFc区微缺失的最佳选择，即a (sY84、sY86)，b (sY127、sY134)，c (sY254和sY255)，该引物组可满足常规诊断，能够检测3个AZF区域中几乎所有的临床相关的缺失和95%以上的缺失，指南推荐实验室尽量使用该组引物，统一实验标准，避免过多或者过少的引物检测，并且可以比较各个实验室的性能和实验室的变异性。

无精子症男性的微缺失发生率高于少精子症男性，不同实验室发现的缺失频率在2%~10%之间^[1]。本研究发现，AZFc缺失是最常见的Y染色体微缺失，且约2/3的AZFc缺失患者有精子存在，因此，对于AZFc及AZFd缺失的患者更应不放弃希望，积极鼓励其治疗并生育具有自己血缘关系的子代，但需要进行遗传咨询。患者如要求避免将缺失传递给下一代，建议行三代试管(胚胎植入前的染色体诊断) 生育女性子代。有文献^[2]报道，由于c缺失中有部分人群精子并未受到影响，可以正常生育，但极有可能在生育下一代男孩的过程中出现更多位点的缺失。

本研究中，包含AZFa区主要位点(sY84、sY86) 或包含AZFb区主要位点(sY127、sY134) 微缺失的患者无一例有精子，这完全符合2013年欧洲指南的解读。AZFa区长度仅有1 100 kb，完全缺失AZFa区会缺失大约792 kb，这仅有的极小的片段缺失会导致绝对的无精子。AZFa区包含单拷贝基因USP9Y (前身为DFFRY) 和DDX3Y (前身为DBY)，这是仅有的2个基因。编码RNA解旋酶DDX3Y的基因位于Y染色体的AZFa区域，仅在雄性生殖细胞中表达，包含DDX3Y基因的缺失会导致无精症，并导致人类唯支持细胞综合征(sertoli cell only syndrome，SCOS)。SCOS的特征是缺少完整的生殖细胞，但保留了体细胞的支持细胞，属于绝对的无精子症^[3]。因此，此二类患者行药物生精治疗和显微取精手术前需要得到患者的充分知情同意，以决定是否仍坚持该治疗及手术。AZFa部分缺失的病例极为罕见，我国曾有1例关于a部分缺失(缺失位点sY86) 有精子存在的个例报道^[4]，精子浓度为68×10⁶/mL，前向运动精子百分率为40%，有待于进一步的求证和复核。

AZFb区的完全位点缺失会导致生精阻滞在初级精母细胞阶段，从而无法产生精子。本研究中，包含sY127、sY134位点缺失的37例患者中，无一例存在精子。有2例患者为部分b+cd缺失，只有极少量精子存在，因为其b区只有1个位点sY143缺失，主要位点sY127、sY134 (欧洲指南指定检测位点) 均存在，精子数量分别为4 (隐匿性无精子，经离心后可见) 及0.13×10⁶。

在AZF的分区中，只有AZFa区是独立的，AZFb区与AZFc区有约1.5 Mb的重叠，因而关于这些重叠区域应该划分为b区还是c区常存在争议解读^[5]。部分缺失会偶有存在精子的病例报道，完全缺失则不会。AZFb的完全缺失会去除6.2 Mb区域(包括32个基因和转录单位的拷贝)，并且是回文P5/近端P1之间同源重组的结果。AZFc缺失区可去除3.5 Mb区域(包括12个基因和转录单位，每个基因和转录单位的拷贝数可变，共32个拷贝)，分别来自回文P3和P1中扩增子b2和b4的同源重组，并去除21个基因拷贝和转录单位^[6]。

AZF微缺失区间是由大的同源重复序列块之间的染色体内重组事件引起的。在同一Y区域，在可育男性中可观察到较大的基因组异质性，只有完整的AZFa和AZFb缺失与特定的睾丸病理相关。AZFc的部分缺失甚至对男性生育力没有影响。这表明AZFb和AZFc中多拷贝基因的遗传冗余以及Yq11重复结构中出现的首个微缺失与大缺失之间的因果关系，其中大回文可能促进多个基因转换和AZF重排^[7]。有研究^[8]将Y染色体上的AZFc区基因族分组，命名为无精子症缺失基因(deleted in azoospermia，DAZ)，包括DAZ1、DAZ2、DAZ3和DAZ4等4个家族成员，很多正常生育的男性和不育的男性患者中均可存在gr/gr-DAZ1/DAZ2、DAZ3/DAZ4缺失，所以DAZ只是可能导致男性不育的危险因子之一，而不能作为一个直接的致病遗传因素，该分类在临床工作中并不常用。

本研究中，AZFd区的sY145、sY152位点缺失患者占总检测例数的0.24%，在微缺失类别中占5.45%，比例很低，且89%有精子，精子数量介于0~60×10⁶之间，存在男性不育的可能。但是否进行AZFd缺失检测存在争议，如不进行该位点检测，缺失将被强制传播给雄性后代，在下一代中，部分缺失有可能扩展为完全的缺失从而影响生育，持有异议者认为标记物数量过多的新方法和试剂盒不会提高测试的灵敏度，甚至会使结果的解释复杂化，因而不建议使用^[1]。

近期有学者发现AZF基因(主要是AZFa和AZFb基因座中的基因) 在多种组织中广泛表达，并预测这些基因将在基因调控和蛋白质合成等过程中发挥作用。部分研究结果表明，AZF基因可能具有超出生育力调节的功能：(1) 使用具有Y染色体微缺失的男性精子辅助繁殖时，会产生劣质的胚胎；(2) AZF基因缺失的男性中观察到较高的神经精神病学障碍；(3) AZF基因的拷贝数变异和在几种癌症中发现了AZF基因表达的改变^[8]，有待于进一步发现和验证。

总之，AZFc缺失是最常见的Y染色体微缺失，约2/3的AZFc缺失患者自然状态下就有精子存在，经过治疗后有可能找到更多精子。各个检测机构在AZF检测时需要包括欧洲指南指定位点，其余位点可以适度增加(比如AZFd缺失的位点sY145、sY152)，但不应过度解读，需要结合精子数量的实际情况分析。建议适当扩大检测指征，而并非只对严重少弱精患者进行AZF微缺失检测。值得注意的是，某些非常规检测位点缺失将被强制传播给雄性后代，在下一代中，部分缺失有可能扩展为完全的缺失而影响生育。