近年来，急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)和慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)的发病率呈上升趋势。研究^[1]表明AKI是CKD的独立危险因素。AKI后肾脏不良修复会导致进行性肾纤维化和CKD。由AKI发展而来的CKD称为AKI-CKD转变^[1-2]。研究^[3-5]表明，AKI后随着时间延长，血清肌酐可以回归到基线水平，但肾内细胞炎症反应仍持续存在，导致肾纤维化和长期肾功能不全。在这过程中，缺氧、营养物质不足、ATP消耗、活性氧产生和Ca²⁺稳态破坏可引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。

槐耳是一种生长在槐树树干上的浅褐色伞菌类真菌，作为中药已有1 500余年历史。研究^[6]显示槐耳提取物治疗的不良反应很少。已有研究^[7-8]表明槐耳对肾脏损伤有保护作用。然而槐耳在AKI-CKD转变中的作用及其与ERS的关系研究鲜有报道。本研究采用缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)建造AKI-CKD小鼠模型，探讨槐耳对AKI-CKD转变的影响及其作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物、药品及分组

72只雄性6~8周龄C57BL/6小鼠购自辽宁长生生物有限公司，动物饲养于SPF级实验室，温度为(25±2) ℃，湿度50%~70%，昼夜节律12 h光照/12 h黑暗，正常饮食。槐耳浸膏由启东盖天力药业有限公司提供。将小鼠随机分为3组：假手术(Sham)组、IRI组和槐耳治疗(IRI+Huaier)组，每组24只。

1.2 模型制备与给药

IRI组进行缺血再灌注手术，小鼠戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定在手术台上，局部皮肤脱毛，无菌下行腹部正中切口，找到肾动脉，利用非创伤性微血管夹，夹闭双侧肾蒂30 min；Sham组只开腹；在肾缺血期间暂时关腹，去除微血管夹后确定肾动脉再灌注成功后分层缝合关闭腹腔。IRI+Huaier组操作同IRI组，手术后3 d开始槐耳浸膏[6 g/ (kg·d)]灌胃，持续至术后28 d。

1.3 方法

1.3.1 肾功能检测

各组小鼠分别于造模后24 h、3 d、7 d、14 d、28 d尾静脉采血，常温静置2 h，4 ℃离心10 min，分离血清，留取标本后-20 ℃保存。采用脲酶UV法检测血肌酐水平。

1.3.2 ELISA检测

血清中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL)水平测定按照ELISA试剂盒(SEB388Mu，武汉Uscnk公司)说明书操作进行。

1.3.3 肾组织形态学观察

于造模后28 d处死各组小鼠，剖腹取肾，用10%多聚甲醛固定，制作石蜡切片(片厚3 μm)，HE染色，复染，脱水、透明后用中性树胶封片，光镜下观察肾组织形态学改变。肾组织中胶原形成情况检测：各组小鼠于造模后28 d处死，剖腹取肾，10%多聚甲醛固定，制作石蜡切片(片厚3 μm)，Masson染色观察肾脏胶原形成、肾脏纤维化程度，计算各组肾小管损伤评分和间质纤维化百分比^[9]。

1.3.4 Western blotting检测ERS相关分子GRP78、CHOP表达

提取造模后28 d肾组织蛋白，加入上样缓冲液后依次上样，并加入Marker蛋白，电泳起始电压为80 V，当溴酚兰移动到分离胶时改为120 V电压，当溴酚兰跑出胶面时关闭电源终止电泳。电泳结束后，将分离的蛋白条带转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，进行一抗(GRP78、CHOP抗体)孵育，随后进行二抗孵育，洗膜，配制ECL底物发光液，化学发光成像系统C300进行显色发光，采用Image J软件分析蛋白质条带的光密度值。

1.3.5 TUNEL实验

组织切片脱蜡至水后滴加0.1% Triton X-100 (0.1%柠檬酸钠盐配置) 50 μL，室温放置8 min。PBS漂洗3次，5 min/次。配制TUNEL反应液：Enzyme solution及Label Solution按1:9配制，滴加TUNEL反应液(50 μL)。保湿、避光、37 ℃孵育60 min。PBS漂洗，滴加DAPI至完全覆盖组织，避光复染5 min。PBS漂洗，滴加荧光淬灭剂封片。显微镜下观察染色效果并拍照。

1.4 统计学分析

数据处理采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以x±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 小鼠AKI后肾纤维化模型构建

结果显示，术后IRI组各时间点肌酐水平均较Sham组升高(P < 0.05)。小鼠在IRI术后24 h血肌酐明显升高，达到最高峰，术后第3天肌酐水平下降，第7天肌酐迅速下降，第28天肌酐显著下降，肾功能明显恢复。说明小鼠AKI后肾纤维化模型成功构建。IRI+Huaier组术后7 d和28 d肌酐水平均较IRI组下降，肾功能较IRI组恢复明显(P < 0.05)。见图 1。

2.2 各组肾组织形态学观察结果

HE染色结果：光镜下可见Sham组小鼠肾小管基底膜完整，小管上皮细胞结构清晰，无炎症细胞浸润；IRI组肾小管弥漫性扩张，肾小管上皮细胞肿胀变性、坏死，部分萎缩、刷状缘消失，间质可见弥漫单核细胞浸润，间质纤维化；IRI+Huaier组小鼠肾间质纤维化程度明显减轻，肾小管上皮细胞无萎缩和代偿性肥大，未见间质水肿。Masson染色结果：与Sham组比较，IRI组胶原纤维增多，肾间质增宽，间质细胞及细胞外基质成分增多，表现为多灶状纤维化；IRI+Huaier组肾脏纤维化程度低于IRI组，但仍高于Sham组。术后28 d IRI组肾脏损伤及纤维化程度较Sham组升高(P < 0.01)，而IRI+Huaier组较IRI组肾脏损伤及纤维化程度减轻(P < 0.01)。IRI组术后28 d NGAL水平较Sham组明显上调(P < 0.001)；而IRI+ Huaier组NGAL水平较IRI组明显降低(P < 0.001)，见图 2。

2.3 Western blotting检测各组小鼠肾组织GRP78、CHOP蛋白的表达

结果显示，IRI组GRP78、CHOP表达与Sham组比较明显增加(P < 0.01)，IRI+Huaier组GRP78表达与IRI组比较显著下降(P < 0.05)。见图 3。

2.4 TUNEL法检测各组细胞凋亡结果

Annexin V/PI双染色显示，sham组、IRI组、IRI+ Huaier组凋亡细胞百分比分别为(1.32±0.36) %、(12.34±1.99) %、(8.16±1.60) %，与Sham组比较，IRI组凋亡细胞明显增加(P < 0.001)；与IRI组比较，IRI+ Huaier组凋亡细胞明显减少(P < 0.001)，见图 4。

3 讨论

本研究以IRI后小鼠作为AKI动物模型来研究槐耳对AKI-CKD作用。造模采用常用的双侧肾脏缺血再灌注模型，结果显示，IRI后肾功能随着时间延长逐渐恢复，术后28 d时血肌酐接近正常值，但HE、Masson染色结果和血清NGAL水平升高说明肾脏损伤及间质纤维化仍十分明显。IRI+Huaier组血肌酐水平较IRI组下降，说明槐耳可保护AKI后肾功能；28 d时HE、Masson染色结果显示肾脏损伤及纤维化程度较IRI组减轻，说明槐耳可以减轻AKI后肾损伤及纤维化程度。

最近，研究^[10]指出肾脏近曲小管的ERS在IRI损伤导致的AKI后肾纤维化过程中持续存在，参与肾脏纤维化的发生发展，持续的ERS可引发凋亡^[11]，GRP78表达于细胞质，是ERS的标志性蛋白之一，当内质网功能紊乱时，非折叠蛋白在内质网腔内堆积，致使GRP78与PERK、ATF6、IRE1分离，GRP78表达增高是ERS发生和存在的标志^[12]，CHOP主要表达于细胞核，是转录因子家族C/EBP的成员之一，在正常生理情况下表达极低，而当发生过度的ERS时其表达显著被诱导，调控下游细胞凋亡相关基因表达^[13]。XU等^[14]在UUO模型中发现ERS活化并能促进肾脏纤维化。

研究^[15]显示，槐耳通过刺激细胞因子释放和产生活性氧、一氧化氮来调节先天免疫，潜在的不良反应是恶心和呕吐。槐耳浸膏对顺铂诱导的小鼠AKI具有保护作用，可能机制是通过抑制肾小管上皮细胞炎症、凋亡发生而实现^[7]。槐杞黄(槐耳为主要成分)可通过抑制ESR，抑制足细胞GRP78和CHOP表达，保护高糖诱导的小鼠足细胞损伤，降低细胞凋亡^[8]。目前尚无槐耳在AKI-CKD转变过程中的作用及机制研究。参照既往药物干预AKI-CKD转变的相关研究^[16]，本研究发现IRI组内质网相关分子GRP78和CHOP表达较Sham组明显升高，提示AKI-CKD进展过程中，ERS参与肾脏纤维化损伤的过程，与SHU等^[17]研究结果一致。此外，本研究结果显示槐耳治疗显著减少了细胞凋亡，保护了IRI诱导的肾小管细胞，推测这种保护作用是通过抑制ERS和凋亡介导的。FANG等^[18]发现槐耳通过减少顺铂诱导的肾脏损伤和凋亡来改善肾功能，与本研究结果一致。

综上所述，槐耳能够改善AKI后肾纤维化小鼠肾功能，延缓肾损伤及肾间质纤维化进程，其机制可能是通过抑制ERS和凋亡实现的。槐耳不良反应小，对肾脏有着强大的保护作用，它在AKI-CKD转变过程中的其他作用机制还需进一步研究探索，以便为肾纤维化的治疗提供新的思路。