2021, Vol. 50文章信息
- 刘殿勇, 张帅, 许亚坤, 高莉娟, 杨进益, 魏伟
- LIU Dianyong, ZHANG Shuai, XU Yakun, GAO Lijuan, YANG Jinyi, WEI Wei
- TERT基因在乳头状肾细胞癌中的独立预后作用
- Independent prognostic role of the TERT gene in papillary renal cell carcinoma
- 中国医科大学学报, 2021, 50(7): 616-620
- Journal of China Medical University, 2021, 50(7): 616-620
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文章历史
- 收稿日期：2021-01-08
- 网络出版时间：2021-06-22 16:54
引用本文 |
2. 大连医科大学附属大连市友谊医院泌尿外科, 辽宁 大连 116100
2. Department of Urology, Affiliated Dalian Friendship Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116100, China
肾乳头状细胞癌(papillary renal cell carcinoma，PRCC)是肾癌的第二常见类型，约占肾癌病例总数的15%~20%[1]。PRCC是一种异质性疾病，其潜在的分子机制还不完全清楚[2]。此外，靶向治疗对晚期PRCC患者的疗效尚不确定。目前，人们对确定PRCC患者预后的最佳风险基因特征尚未达成共识[3]。因此，迫切需要寻找新的预后生物标志物和治疗靶点来提高PRCC患者的生存率。
随着高通量基因检测技术的发展，生物医学大数据被广泛应用[4-5]。从单个样本中收集大量的基因组信息，从而可以识别新的预后、预测或药效生物标志物[6]。目前，基因表达水平的微阵列或RNA测序数据常用于通过Cox风险回归模型构建新的预后特征。通过微阵列和测序方法以及可用的开放存取数据库如癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)，已经在PRCC等多种癌症中发现生物标志物，为在全球基因水平上筛选预后基因提供了机会[7]。
本研究利用TCGA数据库中PRCC患者的基因表达谱数据和临床信息，对正常人和PRCC患者的基因进行差异分析，基于差异基因筛选与患者生存显著相关的基因，并进一步探讨该基因是否能成为新的PRCC预后标志物，为PRCC患者的治疗提供新靶点。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞系人胶质瘤细胞系SK-RC-39 (中国科学院上海细胞所)。
1.1.2 主要试剂高糖DMEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)；TRIzol试剂、Lipofecamine 2000、cDNA-TERT和阴性对照(美国Invitrogen公司)；PrimeScript逆转录试剂盒以及SYBR PCR Master Mix (宝生物工程有限公司)；MTT试剂(美国Sigma公司)。
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养和转染细胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基，于5% CO2、37 ℃培养箱内培养和传代。按Lipofectamine 2000转染试剂盒操作说明进行cDNA转染，诱导TERT过表达。
1.2.2 Western blotting将转染和未转染TERT的细胞培养48 h后，裂解并提取蛋白，检测TERT蛋白的表达。
1.2.3 MTT方法检测细胞增殖将转染和未转染TERT的细胞在96孔板中按照5×103/孔进行铺板，培养24、48、72、96 h后，加入MTT (5 mg/mL)，随后溶于DMSO (100 μL/孔)，酶标仪检测各孔吸光度值(490 nm波长)，实验重复3次。
1.3 生物信息学分析通过TCGA数据库(http://cancergenome.nih.gov)下载PRCC患者的RNA-seq数据和临床数据，包含289例PRCC患者和32例正常人。排除5例无总体生存期(overall survival，OS)的患者样本，共有284例PRCC患者样本纳入分析。基因表达值以每100万标记读本中每千碱基外显子的读本数进行估算。此外，不同样本间通过中位数法进行标准化处理。RNA-seq原始数据集用R语言edgeR包进行处理，对原始数据进行背景校正、标准化。错误发现率(false discover rate，FDR) < 0.05视为差异有统计学意义。
将差异基因投入到单因素Cox风险回归分析中，进一步利用R语言survival包绘制Kaplan-Meier曲线，通过log-rank检验TERT低表达和高表达2组患者的生存时间有无统计学差异。然后利用R语言pROC包绘制受试者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，筛选出与PRCC患者OS相关的独立预后基因。此外，将临床病理参数(TNM分期、性别和年龄)作为协变量进行单因素和多因素Cox风险回归分析，鉴定独立预后风险因素。
1.4 统计学分析采用GraphPad 7.0和SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，2组比较采用Student’s t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 初步筛选出16个生存相关差异基因从TCGA数据库中下载PRCC患者的基因表达谱数据和临床信息。通过对284例PRCC患者和32例正常人基因进行差异分析，采用严苛的标准筛选出74个差异表达的基因(log FC > 5，FDR < 0.05)，见图 1A。经过进一步Cox风险回归分析，发现这74个差异基因中有16个与患者生存相关(P < 0.05)，见图 1B。其中14个基因风险比(hazard ratio，HR) > 1，表明随着基因表达量增加，患者死亡风险增加。
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| A, analysis of differentially expressed genes in normal subjects and PRCC patients; B, survival-related differentially expressed genes in PRCC patients. 图 1 初步筛选出16个生存相关差异基因 Fig.1 Preliminary screening of 16 survival related genes |
2.2 生存相关差异基因的预后分析
基于Kaplan-Meier生存曲线，进一步分析16个基因的表达水平与PRCC患者OS的相关性。结果提示，只有TERT基因和VSTM2L基因的表达水平与PRCC患者OS相关。TERT高表达与PRCC患者OS较短相关(P = 0.009，图 2A)，且ROC曲线表明，TERT基因可以准确预测患者的预后[曲线下面积(area under the curve，AUC) =0.713]。而VSTM2L基因的表达水平虽然与PRCC患者OS相关(P = 0.004)，但ROC曲线表明，VSTM2L基因不能准确预测患者生存(AUC=0.381)。以上结果表明，TERT基因可以准确预测PRCC患者预后。
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| A,Kaplan-Meier survival curve and ROC curve of TERT gene in PRCC patients; B, Kaplan-Meier survival curve and ROC curve of VSTM2L gene in PRCC patients. 图 2 TERT基因和VSTM2L基因对PRCC患者生存的预测作用 Fig.2 The survival predictive effect of TERT and VSTM2L genes in PRCC patients |
2.3 TERT基因对PRCC的独立预后作用
与正常人相比，PRCC患者中TERT基因表达增加，差异有统计学意义(P < 0.05)，见图 3A。PRCC患者中，随着TERT表达量增加，患者生存时间缩短，死亡人数增加，这与之前证明的TERT是风险因素(HR > 1)的结果一致。随后，为了证实TERT基因不受临床因素影响，可以作为独立风险因素预测患者的预后，将TERT基因及临床病理参数(TNM分期、性别和年龄)投入到单因素Cox风险回归分析中，发现TERT基因(P = 0.029，图 3C)、N分期(P = 0.001，图 3C)和T分期(P < 0.001)与PRCC患者OS显著相关。多因素Cox回归分析结果提示，TERT基因(P = 0.005，图 3D)和N分期(P = 0.011，图 3D)具有独立预测PRCC患者OS的潜在作用，TERT高表达提示PRCC患者具有高死亡风险。
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| A, gene expression level of TERT in normal subjects and PRCC patients; B, the distribution of survival state in PRCC patients with the increase of TERT expression; C, univariate and multivariate Cox hazard regression analysis of clinical factors. 图 3 TERT基因对PRCC的独立预后作用 Fig.3 Independent prognostic effect of TERT gene on PRCC |
2.4 诱导PRCC细胞中TERT表达后增殖活性增加
上述结果提示TERT在PRCC中可能发挥促癌基因作用，进一步通过细胞实验进行验证。将cDNA-TERT转染至SK-RC-39细胞中，Western blotting结果发现，与未转染组比较，细胞转染cDNA-TERT后TERT表达明显增加(图 4A)，即有效诱导细胞中TERT高表达。接下来，通过MTT方法检测细胞增殖水平的改变，结果发现，TERT基因过表达可使SK-RC-39细胞增殖活性增加(图 4B)，提示TERT可能通过调控细胞增殖活性发挥促癌作用。
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| A, the expression of TERT protein was detected by Western blotting; B, cell proliferation was detected by MTT assay. 图 4 TERT过表达对PRCC细胞细胞增殖的影响 Fig.4 Effect of TERT overexpression on proliferation of PRCC cells |
3 讨论
PRCC是第二常见肾癌类型，但由于病例数有限，关于PRCC的分子机制研究和随机临床试验很少[8]。因此，与PRCC进展相关的分子机制尚不清楚[9]。尽管目前临床存在多种PRCC治疗方法，但患者预后不良[10]。因此，迫切需要寻找有效的预后生物标志物，以便准确预测预后，提高PRCC患者的生存率。
近10年来，RNA测序及基因芯片等技术不断成熟，其准确度和精确度都大幅提高，形成了癌症相关的大数据[5, 11]。利用生物信息学手段挖掘这些大数据，可以方便地找到可能与PRCC发生、发展相关的基因。与传统研究相比，更加经济且有效地缩短了研究周期。目前，已有多篇文献[12-15]基于生物信息学对PRCC进行预后分析。
本研究中，基于PRCC患者和正常人的基因表达数据，初步筛选出74个差异表达基因。进一步采用单因素Cox风险回归分析，筛选出16个基因与患者生存相关。随后，Kaplan-Meier生存分析发现只有TERT基因(P = 0.009)和VSTM2L基因(P= 0.004)可以预测患者生存。但是ROC曲线证实，仅TERT基因可以准确预测PRCC患者预后(TERT：AUC=0.713；VSTM2L：AUC=0.381)，即TERT高表达患者的OS较TERT低表达患者明显缩短。对临床因素进行单因素和多因素Cox风险回归分析发现，TERT (P = 0.005)和N分期(P < 0.001)是PRCC患者的独立预后因素。
总之，本研究系统证明了TERT基因与PRCC进展显著相关。TERT基因可以准确、独立地预测PRCC患者的预后。本研究结果表明，TERT基因是PRCC潜在的诊断和预后生物标志物，为今后对PRCC的基础研究和临床辅助治疗提供了参考。但本研究仅基于生物信息学分析，需要更大样本的同类数据进行验证，并同时开展相关的临床和基础实验，以确认这些指标的稳定性和实用性。
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