胶质瘤是中枢神经系统中最具侵袭性和致死性的肿瘤，以高复发率和高死亡率为显著特征^[1]。尽管许多学者付出了巨大努力，但在胶质瘤治疗方面几乎没有取得进展^[2]。胶质母细胞瘤是恶性程度最高的颅内恶性肿瘤，属于Ⅳ级恶性胶质瘤，是仅次于脑膜瘤的第二常见中枢神经系统肿瘤，同时也是侵袭性最高的颅内恶性肿瘤^[3]。在无任何治疗情况下，胶质母细胞瘤患者中位生存时间仅为3个月^[4]。因此，研究胶质母细胞瘤的潜在生物标志物并为疾病的诊断和治疗提供新的见解至关重要。过去的十年中，表观遗传修饰尤其是DNA甲基化，已成为癌症研究的重点。DNA甲基化的变化可能会影响基因表达和反馈机制，并产生各种促进或抑制肿瘤的作用^[5]。目前，研究已经报道多种甲基化基因生物标志物，如MGMT启动子甲基化是胶质瘤预后的主要生物标志物^[6]，并可预测胶质母细胞瘤患者对替莫唑胺治疗的反应性^[7]。本研究利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和UCSC Xena数据库中胶质母细胞瘤患者的相关数据，对复发与无复发胶质母细胞瘤组织的基因甲基化差异程度进行分析，筛选出具有差异甲基化的基因，并进一步探讨该基因能否成为新的胶质母细胞瘤预后标志物，为胶质母细胞瘤的治疗提供新的策略。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细胞系

人胶质瘤细胞系U373，购自中国科学院上海细胞所。

1.1.2 主要试剂

高糖DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）；TRIzol试剂、Lipofecamine 2000、LYSMD1 cDNA和阴性对照（美国Invitrogen公司）；PrimeScript逆转录试剂盒、SYBR PCR Master Mix（宝生物工程有限公司）；MTT试剂（美国Sigma公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和转染

细胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基，于5% CO₂、37 ℃培养箱内培养和传代。按Lipofectamine 2000转染试剂盒说明操作进行cDNA转染，诱导LYSMD1过表达。

1.2.2 Western blotting

将U373细胞分为转染LYSMD1 cDNA的LYSMD1过表达组和不加任何处理因素的阴性对照组。2组细胞均在培养48 h后，裂解并提取蛋白，进行Western blotting，检测目的蛋白的表达。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖

将U373细胞分为转染LYSMD1 cDNA的LYSMD1过表达组和不加任何处理因素的阴性对照组。细胞铺96孔板，5×10³/孔，培养24、48、72、96 h后，培养前加入MTT（5 mg/mL），随后溶于DMSO（100 μL/孔），酶标仪检测各孔吸光度值（490 nm波长），实验重复3次。

1.3 生物信息学分析

通过TCGA（http://cancergenome.nih.gov）数据库下载胶质母细胞瘤患者的转录组RNA-seq数据和临床数据，包含160例胶质母细胞瘤组织样本。排除2例无复发生存期（recurrence-free survival，RFS）为0的患者样本，共158例胶质母细胞瘤样本纳入分析。根据有无复发，将158例胶质母细胞瘤患者分为复发组（n = 93）和无复发组（n= 65）。通过UCSC Xena（https://xenabrowser.net/datapages）数据库下载胶质母细胞瘤患者的DNA甲基化数据，共158例胶质母细胞瘤样本纳入DNA甲基化分析。

每个检测的CpG位点的甲基化水平均由β值表示，β值是一组0~1范围的连续变量，0代表完全未甲基化，1代表完全甲基化，β值分布符合非对称双峰分布。RNA-seq原始数据集用R语言“edgeR”软件包进行数据处理，对原始数据进行背景校正、标准化。DNA甲基化数据用于差异甲基化分析。比较复发组和无复发组，鉴定出差异甲基化的CpG位点。错误发现率（false discovery rate，FDR） < 0.05为差异有统计学意义。

将差异基因投入到单因素、多因素Cox回归分析中，并将临床病理参数（年龄、种族、性别、肿瘤状态）作为协变量进行分析，筛选出与胶质母细胞瘤患者RFS相关的独立预后基因。

1.4 统计学分析

采用GraphPad 7.0和SPSS 19.0软件进行统计分析。生存分析采用Kaplan-Meier法并用log-rank进行检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 初步筛选出23个差异甲基化的CpG位点

从UCSC Xena数据库中下载胶质母细胞瘤患者的DNA甲基化数据，共获得485 578个CpG位点。通过对复发组和无复发组进行比较，筛选出23个差异甲基化的CpG位点。与无复发组相比，复发组中9个CpG位点甲基化程度显著下调，14个CpG位点甲基化程度显著上调。见图 1、表 1。

2.2 差异甲基化的LYSMD1基因表达水平与胶质母细胞瘤患者预后相关

进一步分析发现，23个差异甲基化的CpG位点对应20个基因（表 2）。分别比较这20个基因在复发组和无复发组的差异表达情况。结果显示，在这20个基因中，仅LYSMD1基因的表达在复发组和无复发组间存在统计学差异（P = 0.024 9，图 2A、表 2）。与复发组相比，无复发组LYSMD1基因显著高表达，这与前面分析的复发组LYSMD1基因的CpG位点甲基化程度显著上调这一结果相符。见表 1、表 2。

利用Kaplan-Meier生存曲线，进一步分析LYSMD1基因的表达水平和胶质母细胞瘤患者RFS之间的相关性。结果显示，LYSMD1基因的表达水平与胶质母细胞瘤患者RFS显著相关，LYSMD1高表达与胶质母细胞瘤患者较长RFS相关（P = 0.031 3，图 2B）。将LYSMD1基因和临床病理参数（年龄、种族、性别、肿瘤状态）投入到单因素Cox回归分析中，结果发现，LYSMD1基因（HR = 0.627，95%CI：0.413~0.950，P = 0.028）和肿瘤状态（HR = 3.467，95%CI：1.735~6.924，P < 0.000 1）与胶质母细胞瘤患者RFS显著相关（图 2C）。多因素Cox回归分析结果提示，LYSMD1基因（HR = 0.583，95%CI：0.384~0.886，P = 0.012）和肿瘤状态（HR = 3.658，95%CI：1.827~7.319，P < 0.000 1）具有独立预测胶质母细胞瘤患者RFS的潜在作用，LYSMD1低表达提示胶质母细胞瘤患者具有高复发风险（图 2D）。

2.3 诱导胶质瘤细胞中LYSMD1表达后细胞增殖减慢

上述结果提示LYSMD1在胶质母细胞瘤中可能发挥抑癌基因作用，进一步通过细胞实验进行验证，将LYSMD1 cDNA转染至U373细胞，通过Western blotting结果发现，与阴性对照组比较，细胞转染LYSMD1 cDNA后，LYSMD1表达明显降低（图 3），即有效诱导细胞中LYSMD1高表达。接下来通过MTT法检测细胞增殖水平的改变，结果发现，LYSMD1基因过表达可使U373细胞增殖活性减弱（图 4），提示LYSMD1可能通过调控细胞增殖活性发挥抑癌作用。

3 讨论

胶质母细胞瘤是一种预后不良的脑肿瘤，尽管目前临床存在多种胶质瘤治疗方法，但其复发率仍居高不下，复发率高是胶质母细胞瘤患者预后不良的重要原因^[1]。研究^[8]证明，DNA甲基化通过调节基因表达影响患者生存。癌基因或抗癌基因甲基化程度过高或过低对不同类型肿瘤的发生和发展有重大影响^[9-11]。目前，已有研究^[12-16]报道了多种甲基化基因生物标志物。

本研究根据胶质母细胞瘤患者有无复发，将患者分为复发组和无复发组，初步筛选出23个差异甲基化的CpG位点，对应20个基因。进一步分析发现，在这20个基因中，仅LYSMD1基因的表达在复发组和无复发组间存在统计学差异。与复发组相比，无复发组LYSMD1基因显著高表达，这与复发组LYSMD1基因的CpG位点甲基化程度显著上调这一结果一致。Kaplan-Meier生存曲线结果提示，LYSMD1高表达患者的RFS较LYSMD1低表达患者明显延长。单因素、多因素Cox回归分析结果提示，LYSMD1和肿瘤状态是胶质母细胞瘤患者RFS的独立预后因素。

到目前为止，关于LYSMD1基因在肿瘤中的作用未见报道，本研究首次提出其可能作为胶质母细胞瘤标志物，影响胶质母细胞瘤细胞增殖。LYSMD1在胶质母细胞瘤中发挥作用的具体分子机制如何，将在今后的研究中深入开展。

综上所述，具有差异甲基化的LYSMD1基因与胶质母细胞瘤患者预后相关，可能成为胶质母细胞瘤预后分析的新指标，为今后对胶质母细胞瘤的基础研究和临床辅助治疗提供参考。但本研究仅基于生物信息学分析，未来需要更大样本的同类数据进行验证，同时开展相关的临床和基础研究，以确认这些指标的稳定性和实用性。