肺癌是全世界最主要的癌症死亡原因之一^[1]。肺癌根据组织学分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌，肺癌患者中NSCLC约占85%^[2]。研究^[3]发现，有2/3的NSCLC患者在诊断时已处于Ⅲ/Ⅳ期，并且超过50%的患者在诊断时已经出现转移，转移性晚期NSCLC患者5年生存率低于5%，提高晚期NSCLC患者的生存率需要更多新的治疗策略^[4]。免疫微环境在控制肺癌发生、发展和转移中起着至关重要的作用^[5]。近年来白细胞介素-9（interleukin-9，IL-9）在肿瘤免疫中的作用得到了越来越多的关注。研究^[6]发现在肺癌恶性胸腔积液中辅助性T细胞9（helper T cell 9，Th9）及其分泌的细胞因子IL-9可促进肺癌细胞增殖及迁移，同时促进肺癌细胞与胸膜间皮细胞间黏附，进而促进肺癌恶性胸腔积液进展^[6]。但是也有研究^[7]发现在不同的肿瘤微环境中IL-9及Th9细胞具有复杂的抗肿瘤及促肿瘤的双重作用。在黑色素瘤中Th9及IL-9促进CD8⁺T细胞介导的细胞毒性，进而发挥抗肿瘤作用^[8]。IL-9通过刺激抗肿瘤M1巨噬细胞抑制黑素瘤的肺转移^[9]。

目前，癌症中IL-9促肿瘤和抗肿瘤的作用仍然存在争议。对于IL-9、白细胞介素-9受体（interleukin-9 receptor，IL-9R）表达与NSCLC的临床及病理特征关系的研究鲜有报道。本研究探讨NSCLC组织中IL-9、IL-9R表达水平及其与临床病理特征之间的关系，旨在为NSCLC免疫治疗提供新的治疗思路。

1 材料与方法 1.1 材料

收集110例2017年1月至2018年12月中国医科大学附属盛京医院胸外科手术切除并经过病理确诊的NSCLC的癌组织及其癌旁正常肺组织（距肿瘤边缘5 cm以上）石蜡包埋标本。收集其中19例新鲜NSCLC癌组织及其周围正常肺组织，新鲜组织在液氮中保存。110例患者中男80例，女30例；平均年龄（58.9±7.9）岁，其中年龄 < 50岁28例，≥50岁82例；病理分级（分化程度）中高分化80例，低分化30例；肿瘤直径 < 3 cm 42例，肿瘤直径≥3 cm 68例；明确淋巴结转移（N₁、N₂和N₃）54例，无淋巴结转移（N₀）56例。根据TNM分期^[10]分为：Ⅰ期36例，Ⅱ期28例，Ⅲ期44例，Ⅳ期2例。

1.2 免疫组织化学染色及结果判读

石蜡切片进行脱蜡，抗原修复；3%H₂O₂室温孵育15 min，洗片，5%BSA50 µL滴入进行封闭。在室温下孵育10 min；滴加IL-9（ab203386；1∶200；英国Abcam公司）、IL-9R一抗（ab233757；1∶200；英国Abcam公司）4 ℃孵育过夜。然后加入二抗室温60 min静置，PBS洗片3次；DAB显色5 min，苏木精复染，脱水、透明、封片观察。

染色结果由2位病理科医生综合判定。随机观察10个视野（×200），计数视野内细胞总数及染色阳性细胞数，染色阳性细胞百分比评分：0分，着色细胞≤5%（阴性）；1分，着色细胞 > 5%~25%；2分，着色细胞 > 25%~50%；3分，着色细胞 > 50%~75%；4分，着色细胞 > 75%。染色程度评分：0分，基本未染色；1分，弱染色（呈淡黄色）；2分，中等强度染色（呈棕黄色）；3分，强染色（呈棕褐色）。将染色阳性细胞百分比评分与染色程度评分相加，≥4分为阳性，< 4分为阴性。

1.3 Western blotting检测NSCLC癌组织及癌旁正常组织中IL-9蛋白表达

使用RIPA和1%PMSF提取总蛋白，通过BCA法确定样品的蛋白质浓度。将组织裂解液在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，转移到硝酸纤维素膜上。在室温下用5%脱脂奶封闭90 min，然后室温下孵育一抗，包括兔抗人IL-9抗体（ab203386，1∶1 000，英国Abcam公司）和β-actin抗体（ab179467，1∶5 000；英国Abcam公司），在4 ℃下过夜。在室温下，将辣根过氧化物酶偶联的二抗IgG抗体应用1 h后检测。印迹结果分析使用Las-4000 Image软件和Multi Gauge Ver 3.0软件（日本富士胶片生命科学公司）。

1.4 统计学分析

应用Prism7.0软件进行统计分析，计数资料采用率表示，组间比较采用χ²检验；正态分布的计量资料采用x±s表示，组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 免疫组织化学检测NSCLC癌组织及癌旁组织中IL-9、IL-9R的表达

结果显示，NSCLC癌组织中IL-9阳性表达88例（80%），其中男性64例，女性24例；IL-9阴性表达22例（20%），男性16例，女性6例。癌旁正常组织中IL-9阳性表达30例（27.3%），阴性80例（72.7%）。癌组织中IL-9的阳性表达率明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（χ²=61.489，P < 0.01），见图 1。NSCLC癌组织中IL-9R阳性表达82例（74.5%），其中，男性60例，女性22例；IL-9R阴性表达28例（25.5%），其中男性20例，女性8例。癌旁组织中IL-9R阳性表达12例（10.9%），阴性表达98例（89.1%）。癌组织中IL-9R阳性表达率明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（χ²=91.017，P < 0.01），见图 2。

2.2 Western blotting检测NSCLC癌组织及癌旁组织IL-9表达

结果显示，IL-9蛋白在癌组织中的表达水平（0.63±0.28）较癌旁组织（0.37±0.15）明显增高（P < 0.05），见图 3。

2.3 NSCLC癌组织中IL9及IL-9R的表达与临床指标的相关分析

结果显示，NSCLC癌组织中IL-9的表达与患者性别、年龄、肿瘤分化程度均不相关（均P > 0.05），而与肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期相关（均P < 0.05）。NSCLC癌组织中IL-9R的表达与患者性别、年龄、肿瘤分化程度、肿瘤大小均不相关（均P > 0. 05），而与淋巴结转移、TNM分期相关（均P < 0.001），发生淋巴结转移和分期较晚期患者癌组织中IL-9及IL-9R高表达，见表 1。

3 讨论

IL-9主要由Th9细胞分泌，在支气管哮喘、自身免疫性疾病中发挥关键作用^[11-13]。IL-9与IL-9R结合，激活JAK/STAT通路促进炎症及自身免疫反应^[14]。近年来，IL-9在肿瘤免疫中的作用备受关注。最初研究^[15]认为IL-9是具有潜在致癌活性的T细胞生长因子，IL-9在非实体肿瘤（多数血液系统肿瘤）中驱动肿瘤生长。有研究^[16]发现IL-9可促进弥漫性大B细胞淋巴瘤的细胞存活和耐药性，同时可促进大细胞间变性淋巴瘤的发生及发展。实体肿瘤研究^[17]显示肝癌组织IL-9、IL-9R表达明显高于癌旁组织，IL-9、IL-9R显著促进肝癌细胞增殖、侵袭，抑制细胞凋亡。然而在肺癌实体瘤组织中关于IL-9、IL-9R的研究目前较少，本研究结果显示，肺癌组织中IL-9的表达明显高于癌旁正常组织（P < 0.05），提示IL-9可能促进NSCLC进展。

IL-9具有复杂的双重功能，在不同的肿瘤微环境中可以促进或抑制肿瘤细胞的生长和迁移^[11]。研究^[18]发现Th9细胞分泌的IL-9对于黑色素瘤的生长有抑制作用，将肿瘤抗原特异性Th1、Th9和Th17细胞转移到黑色素瘤小鼠体内，可以明显抑制黑色素瘤的生长。然而Th9细胞的抗肿瘤作用并不局限在黑色素瘤模型中，在乳腺癌模型中Th9、IL-9表达的增高可通过增强CD8+T细胞介导的细胞毒性发挥抗肿瘤作用^[19]。同时也有研究^[20]发现Th9细胞在小鼠结肠腺癌模型、肺腺癌模型中也发挥了重要的抗肿瘤作用。但是也有研究^[6]发现肺癌恶性胸腔积液中，Th9具有促进肺癌进展和转移的作用，恶性胸腔积液中存在大量的促炎症细胞因子，可促进Th9细胞的诱导及分化，其分泌的IL-9通过激活STAT3信号通路促进肺癌细胞的增殖和迁移，抑制γ干扰素对肿瘤细胞的杀伤作用。近期研究^[21]发现IL-9可通过增强NSCLC的血管生成促进肿瘤发生。本研究结果显示IL-9及IL9R表达在NSCLC癌组织较癌旁组织明显增高，IL-9表达与患者肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期相关，IL-9R表达与患者TNM分期和淋巴结转移相关，IL-9及IL-9R在TNM分期较晚及淋巴结转移患者中高表达，说明IL-9可能通过与IL-9R结合促进NSCLC转移和进展。

综上所述，IL-9及IL9R在NSCLC癌组织中高表达，其表达水平与NSCLC的淋巴结转移以及TNM分期相关。因此推测IL-9/IL-9R在NSCLC免疫微环境中起到促癌作用，IL-9/IL-9R可能成为NSCLC调节免疫微环境进行免疫治疗的新靶点，但仍需更多的研究进一步来验证。