2021, Vol. 50文章信息
- 王涛, 陶金, 方烨红, 崔欢, 马超
- WANG Tao, TAO Jin, FANG Yehong, CUI Huan, MA Chao
- 5-羟色胺在小鼠慢性背根神经节压迫模型中的作用机制
- Effect of 5-HT on response to chronic dorsal root ganglion compression in mice
- 中国医科大学学报, 2021, 50(6): 507-510
- Journal of China Medical University, 2021, 50(6): 507-510
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文章历史
- 收稿日期：2020-12-04
- 网络出版时间：2021-05-27 8:55
引用本文 |
慢性背根神经节压迫（chronic compression of dorsal root ganglion，CCD）模型能够最大程度模拟临床腰椎间盘突出患者的症状[1]，是研究慢性神经病理性疼痛的动物模型。背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）初级感觉神经元可以将皮肤感受致痒与致痛刺激通过外周轴突、中枢轴突传递给脊髓[2]。CCD可以增加感觉神经元自发放电活动，提高神经元胞体的兴奋性，增强对温度感受器和化学感受器刺激的反应[3]。5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是抑制性神经递质，广泛存在于哺乳动物组织中，尤其在大脑皮质及神经突触内含量很高。5-HT受体分型比较复杂，已发现7种5-HT受体亚型[4]。5-HT在小鼠CCD模型中引起痛觉与痒觉敏化的作用机制仍不清楚，本研究探讨CCD模型小鼠感受野注射5-HT产生痛觉敏化和痒觉敏化的作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物C57BL/6雄性小鼠24只，体质量25~30 g，分别用于行为学实验（低剂量组6只，高剂量组6只）、免疫荧光实验（左侧为对照侧，右侧为CCD手术侧，n = 6）、实时PCR实验（左侧为对照侧，右侧为CCD手术侧，n = 6）。小鼠饲养和实验程序严格按照北京协和医学院基础医学研究所的《实验动物护理和使用指南》与相关的道德规范执行，自由饮用清洁食物和水，维持12 h的昼夜循环。
1.2 小鼠CCD模型建立3%异氟醚麻醉小鼠，沿背部中线切口，将腰椎旁的肌肉与乳头突、横突分离后暴露右侧腰椎L3、L4椎间孔。将L形的不锈钢棒（直径=0.3 mm，长度=2 mm）插入每个孔中压迫DRG[7]，诱导CCD。然后将切口分层缝合，局部涂抹含有抗生素（TriTop）软膏。小鼠完成行为测试后气体麻醉处死，移除神经外膜并用生理盐水冲洗后对接受CCD手术的DRG进行显微镜检查以确认不锈钢棒位置。
1.3 小鼠行为学分析在一个圆柱形玻璃容器（直径20 cm）底部放置泡沫，泡沫上面以直角放置2个小镜子，以便能够清楚看到小鼠的行为。实验人员使用高清晰摄像机，分别在CCD前1 d和CCD后1、3、5、7 d记录小鼠注射5-HT后的行为。每次实验前将小鼠放在容器中适应环境10 min，然后在小鼠右足皮内注射10 μL 5-HT[8]（低剂量组：0.003 μg/10 μL，n = 6；高剂量组：0.3 μg/10 μL），注射后立即开始记录，持续记录30 min。小鼠注射药物产生伤害性（疼痛）感觉，会舔向注射部位，而瘙痒刺激能引起咬的行为。因此，通过录像视频计算舔和咬注射部位的累积持续时间来评估小鼠疼痛和痒的行为。
1.4 免疫荧光实验小鼠CCD术后5 d，用PBS和4%多聚甲醛经心脏灌注后快速取出L3、L4的DRG，用4%多聚甲醛4℃固定4 h，然后放入30%蔗糖4 ℃过夜。OCT冷冻组织后切片（厚度12 μm）。冰冻切片37 ℃干燥1 h后室温下4%多聚甲醛固定10 min。然后室温下将载玻片在封闭溶液PBS（10%正常马血清、0.2%Triton X-100）中封闭1 h，然后加入一抗兔抗小鼠HRH4（GTX78053，1∶400，美国GeneTex公司）4 ℃孵育过夜。第2天取出后PBS洗3次，每次5 min。然后室温下加入二抗抗兔（A11011，Alexa 568共轭，美国Thermo Fisher公司）孵育1 h，随后PBS清洗3次，使用含有DAPI封片剂封片（美国VECTASHIELD公司），使用Olympus显微镜拍摄图像。
1.5 实时PCR检测按照试剂盒说明书，使用Trizol试剂提取总RNA。以1 µg总RNA为原料，用Prime ScriptTMRT试剂盒和gDNA Eraser合成cDNA。使用SYBR1预混料Ex-TaqTM Ⅱ（TliRNaseH Plus）在25 µL反应体积内扩增出感兴趣基因和GAPDH。实时PCR条件为94 ℃ 30 s，40个周期，95 ℃ 5 s，55 ℃30 s，72 ℃ 60 s。引物序列见表 1。
| Gene | Primer sequence（5’-3’） | Length（bp） |
| GAPDH | F，AGGTCGGTGTGAACGGATTTG | 21 |
| R，GGGGTCGTTGATGGCAACA | 19 | |
| 5-HTr1a | F，GACAGGCGGCAACGATACT | 19 |
| R，CCAAGGAGCCGATGAGATAGTT | 22 | |
| 5-HTr2a | F，TAATGCAATTAGGTGACGACTCG | 23 |
| R，GCAGGAGAGGTTGGTTCTGTTT | 22 |
1.6 统计学分析
使用SPSS 15.0软件进行统计分析，计量资料采用x±s表示，组间比较采用重复测量方差分析；计数资料采用率（%）表示，组间比较采用χ2检验；P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 5-HT对CCD小鼠痛行为的影响结果显示，与小鼠CCD手术前1 d比较，低剂量组小鼠CCD术后1、3 d痛行为增加（P < 0.05）；高剂量组小鼠CCD术后1 d痛行为增加（P < 0.05）。与低剂量组同时间比较，高剂量组痛行为明显增加（均P < 0.05）。见表 2。
| Group | 1 day before CCD | 1 day after CCD | 3 days after CCD | 5 days after CCD | 7 days after CCD |
| Low dose group | 11.83±2.36 | 16.17±1.661） | 22.50±2.881） | 11.67±0.67 | 8.83±2.21 |
| High dose group | 56.50±6.392） | 78.17±9.551），2） | 59.00±5.442） | 64.17±12.822） | 30.67±4.632） |
| 1）P < 0.05 compared with 1 day before CCD in the same group；2）P < 0.05 compared with low dose group at the same time point. | |||||
2.2 5-HT对CCD小鼠痒行为的影响
结果显示，与小鼠CCD手术前1 d比较，低剂量组小鼠CCD术后3 d痒行为增加显著（P < 0.05）；而高剂量组小鼠CCD术后未见痒行为增加（P > 0.05）。与低剂量组同时间点比较，高剂量组小鼠痒行为明显增加（均P < 0.05）。见表 3。
| Group | 1 day before CCD | 1 day after CCD | 3 days after CCD | 5 days after CCD | 7 days after CCD |
| Low dose group | 13.83±2.06 | 14.5±1.66 | 17.33±2.141） | 7.50±1.59 | 5.50±1.57 |
| High dose group | 26.17±1.342） | 31.33±2.572） | 26.33±4.552） | 24.67±6.822） | 10.17±4.472） |
| 1）P < 0.05 compared with 1 day before CCD in the same group；2）P < 0.05 compared with low dose group at the same time. | |||||
2.3 CCD小鼠DRG中H4的表达
免疫荧光实验结果显示，对侧正常DRG的628个神经元中，H4阳性表达的神经元145个（23.08%）；手术侧DRG的685个神经元中，H4阳性表达的神经元241个（35.18%），两者差异有统计学意义（P < 0.05），见图 1。
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| 图 1 小鼠L3和L4 DRG中H4阳性表达结果 ×200 Fig.1 H4 protein expression in L3 and L4 DRG neurons in mice detected by immunofluorescence ×200 |
2.4 CCD小鼠DRG中5-HTr1a和5-HTr2a mRNA的表达
结果显示，对照组中5-HTr1a mRNA、5-HTr2a mRNA分别为20.20±2.18和13.01±1.25，CCD组DRG中5-HTr1a、5-HTr2a mRNA分别为15.13±0.16和10.74±1.12，2组比较差异均有统计学意义（均P < 0.01）。
3 讨论5-HT可以通过2种方式引起瘙痒，一种是直接激活C类伤害性感受器，另一种是通过刺激皮肤的肥大细胞释放组胺来引起瘙痒。本课题组前期研究[5]发现，小鼠CCD模型中受压迫DRG神经元TRPV1表达上调，引起感受野对辣椒素诱发痛敏化。
CCD可以使小鼠受到正常感受力刺激后增加小鼠后足痛觉过敏的发生率[3, 6]。大鼠在腰椎DRG发生CCD后或存在局部炎症时出现机械行为超敏反应[7]。DRG的自发活动研究[9]证实受压迫DRG中感觉神经元细胞体高度兴奋，提高了对电、热和化学伤害性刺激的反应。研究[10]显示，大鼠颈背部中线区域的瘙痒信号主要通过C3 DRG传入脊髓，5-HT受体发挥重要作用。另外，5-HT作为血管活性物质参与偏头痛的发生，以神经递质的方式参与偏头痛的痛觉调节[4]。有研究[11]表明大鼠外周感觉神经元表达的5-HTr2a参与炎症痛的形成。本研究结果显示，与低剂量组比较，高剂量组小鼠CCD术后注射5-HT，痛、痒行为均明显增强（P < 0.05），小鼠DRG中5-HTr1a和5-HTr2a表达明显上调，与痒相关的组胺受体H4表达也明显上调（均P < 0.05），表明5-HT参与了DRG神经元压迫后痛与痒觉敏化过程，抑制5-HT的产生有可能缓解CCD所引起的痛与痒觉的敏化过程。本研究为临床治疗慢性瘙痒与疼痛提供了一个可能的治疗方案和潜在靶点。
综上所述，CCD可引起小鼠痛觉与痒觉过敏，可能是由于受压迫DRG神经元H4、5-HTr1a和5-HTr2a表达上调，引起了感受野对5-HT诱发痛与痒的敏化所致。本研究存在的不足之处：给药方式是皮下注射5-HT，通过刺激外周神经末梢而不是直接作用DRG神经元胞体，不能代表DRG神经元对5-HT刺激的即刻反应情况。今后需对DRG中5-HT产生反应的单个神经元进行单细胞测序，进一步探讨其分子机制。
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