2021, Vol. 50文章信息
- 刘子歌, 今出真司, 张晨, 宋国瑞, 陈德胜
- LIU Zige, IMADE Shinji, ZHANG Chen, SONG Guorui, CHEN Desheng
- 磨损颗粒刺激下小鼠骨髓来源巨噬细胞调控白细胞介素-34表达的实验研究
- Experimental evaluation of the regulation of IL-34 expression in mouse BMMs stimulated by wear particles
- 中国医科大学学报, 2021, 50(6): 496-501, 506
- Journal of China Medical University, 2021, 50(6): 496-501, 506
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文章历史
- 收稿日期：2020-10-23
- 网络出版时间：2021-05-26 15:43
引用本文 |
2. 日本岛根大学附属医院矫形外科, 日本岛根出云 693-8501
2. Department of Orthopedics, Shimane University Hospital, Shimane Izumo 693-8501, Japan
磨损颗粒引起的骨溶解是髋关节或膝关节置换术后假体无菌性松动、假体失效和关节翻修手术的主要原因，严重影响关节功能恢复[1]。假体周围产生的磨损颗粒可引起炎症反应，主要由促炎巨噬细胞表型主导，提示巨噬细胞极化产生的破骨细胞在磨损颗粒引起的骨溶解中起关键作用。核因子κ B受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL）是破骨细胞分化的关键调节剂，由骨髓基质细胞、成骨细胞和活化的T细胞产生的巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）和RANKL是破骨细胞形成所需的细胞因子[2-3]。研究[4]证实，体外培养的RANKL、RANK或TRAF6基因缺陷小鼠的造血干细胞在肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的干预下，也可以分化为破骨细胞，提示破骨细胞分化可能存在其他途径。M-CSF是造血干细胞分化为巨噬细胞系的关键细胞因子，也是小胶质细胞发育必需的。然而，有研究[5]发现，成年M-CSF缺陷小鼠大脑中的小胶质细胞发育正常，表明存在另一种可以替代M-CSF影响该细胞类型的因子。
LIN等[6]发现了一种新的细胞因子白细胞介素（interleukin，IL）-34，它能刺激骨髓细胞的单核细胞活性和巨噬细胞集落形成。因此，本研究假设IL-34作为M-CSF的替代因子，也具有在体外联合RANKL诱导成熟破骨细胞的作用，并可能在磨粒诱导的破骨细胞形成中起关键作用，参与磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解，同时，拟探讨IL-34支持破骨细胞生成的机制。
1 材料与方法 1.1 材料α-MEM、DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；鲎内毒素检测试剂盒（厦门市鲎试剂实验厂有限公司）；IL-34 ELISA试剂盒（英国Abcam公司）；TRAP染色试剂盒（美国Sigma-Aldrich公司）；M-CSF、RANKL、IL-34（美国R & D公司）；Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反转录试剂盒、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit荧光定量PCR试剂盒（日本TaKaRa生物公司）；p38特异性抑制剂SB 202190、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）特异性抑制剂PD 98059、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）特异性抑制剂SP 600125（美国MCE公司）；p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、β-actin抗体（美国Cell Signalling公司）。
1.2 原代细胞获取及TRAP染色按照HU等[7]的方法，从6周龄C57小鼠的后肢股骨骨髓中分离骨髓巨噬细胞。脱颈处死小鼠，并将其在75%乙醇中浸泡15 min。超净台中剥离两侧股骨，剪断两端并用DMEM培养基冲洗，直至骨髓发白。DMEM培养基漂洗并离心后，收集细胞，然后在含有10%FBS与50 ng/mL M-CSF的α-MEM培养基中孵育12 h。收集未贴壁的细胞，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜后，将贴壁细胞视为小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs）。将细胞分为3组：（1）Control组，用含10% 胎牛血清的α-MEM培养基培养；（2）M-CSF组，用含10% 胎牛血清的α-MEM培养基+30 ng/mL M-CSF+100 ng/mLRANKL培养；（3）IL-34组，用含10%胎牛血清的α-MEM培养基+30 ng/mL IL-34+100 ng/mL RANKL培养。每2 d更换1次培养液，直至形成成熟的破骨细胞。用TRAP染色试剂盒对细胞进行分析。TRAP阳性细胞超过3个核认定为破骨细胞，在显微镜下计数。
1.3 钴铬钼合金（cobalt-chromium-molybdenum alloy，CoCrMo）颗粒的准备CoCrMo颗粒由日本岛根大学附属医院矫形外科今出真司博士提供，平均粒径为23.72 nm。将颗粒在121 ℃下高压灭菌15 min。在75%乙醇中重悬钛颗粒，水平摇床晃动48 h后，置于超净工作台中紫外线照射晾干。在后续实验中，将CoCrMo颗粒在细胞培养液中进一步稀释其浓度至10~500 µg/mL不等，并在将其暴露于细胞之前在超声震荡仪中震荡混匀作用5 min。所有颗粒均经过商用鲎内毒素检测试剂盒检测，确保内毒素含量 < 0.1 EU/mL。
1.4 RT-PCR法检测IL-34 mRNA的相对表达量将上述提取到的BMMs在37℃、5%CO2的细胞培养箱中用含有10%胎牛血清、青霉素（100 IU/mL）和链霉素（100 µg/mL）的α-MEM培养基培养。当细胞融合至70%时，加入含0、1、10、100 µg/mL CoCrMo颗粒的培养基培养24 h，或加入100 μg/mL的CoCrMo颗粒分别培养1、6、12、24 h。分别使用特异性信号通路抑制剂[p38特异性抑制剂SB 202190（120 nmol/L），ERK特异性抑制剂PD 98059（120 nmol/L），JNK特异性抑制剂SP 600125（120 nmol/L）]预处理BMMs 1 h后，更换含100 μg/mL CoCrMo颗粒的培养基培养24 h。造模完毕后，使用TRIzol提取总RNA，并使用Prime Script RT Master Mix Kit将1 μg总RNA用于cDNA合成。用Light Cycler FastStart DNA Master SYBR Green I行RT-PCR反应。以β-actin作为内参照。小鼠IL-34引物正向序列为5’-GGACACACTTCTGGGGACA-3’，反向序列为5’-CCAAAGCCACGTCAAGTAGG-3’。以2-ΔΔCt表示细胞中目的mRNA的相对表达量。
1.5 ELISA法检测细胞培养上清IL-34含量分别收集各组的细胞培养上清液，离心去除悬浮的CoCrMo颗粒。按照商用小鼠IL-34 ELISA试剂盒说明书的步骤，对各组细胞培养上清液中IL-34的分泌量进行检测。
1.6 Western blotting检测丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路中转导蛋白的表达量用特异性信号通路抑制剂（120 nmol/L SB 202190、PD 98059、SP 600125）预处理BMMs 1 h，更换含100 μg/mL CoCrMo颗粒的培养基培养24 h后，RIPA裂解细胞，离心，收集上清液。BCA法测定样品蛋白浓度。蛋白（每组30 μg）上样，行10% SDS PAGE，转至PVDF膜，分别加入p38（1︰1 000）、p-p38（1︰1 000）、ERK（1︰1 500）、p-ERK（1︰1 500）、JNK（1︰1 000）、p-ERK（1︰1 000）和β-actin（1︰1 000）一抗，4 ℃孵育封闭过夜，二抗（1︰10 000）室温孵育2 h，显色，曝光。
1.7 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-q检验。所有实验均独立重复3次。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 IL-34可促进RANKL诱导的破骨细胞生成TRAP染色是鉴定破骨细胞分化成熟的金标准，如观察到细胞核≥3个且同时呈TRAP阳性染色（酒红色），即可认定为破骨细胞。M-CSF+RANKL是标准的体外诱导BMMs形成破骨细胞的方法[8]。TRAP染色结果显示，与Control组比较，IL-34组破骨细胞数明显增多，差异有统计学意义（P < 0.05）；与M-CSF组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。提示IL-34在体外同样具有促进破骨细胞形成的作用。见图 1。
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| *P < 0.05. 图 1 IL-34促进RANKL诱导的破骨细胞生成TRAP染色×40 Fig.1 IL-34 promotes RANKL-induced osteoclastogenesis TRAP staining ×40 |
2.2 CoCrMo颗粒可上调BMMs中IL-34的表达
RT-PCR结果显示，CoCrMo颗粒以时间和剂量依赖的方式促进BMMs中IL-34 mRNA的表达（图 2A、2B）。ELISA结果显示，与RT-PCR一致，CoCrMo颗粒诱导的IL-34表达量呈时间和剂量依赖性（图 2C、2D）。
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| A, CoCrMo particles (0, 1, 10, and 100 µg/mL) were treated for 24 hours and then RT-PCR was performed; B, CoCrMo particles (100 µg/mL) were treated on BMMs for different time periods (1, 6, 12, and 24 h), then perform RT-PCR detection; C, CoCrMo particles (0, 1, 10, and 100 μg/mL) were treated for 24 h and then ELISA detection; D, CoCrMo particles (100 μg/mL) were treated on BMMs for different time periods (1, 6, 12, and 24 h) after ELISA. *P < 0.05 vs control group. 图 2 CoCrMo磨损颗粒上调BMMs中IL-34的表达 Fig.2 CoCrMo wear particles up-regulated the expression of IL-34 in BMMs |
2.3 CoCrMo颗粒通过ERK和JNK信号通路调节BMMs中IL-34的表达
MAPK信号转导通路在破骨细胞调控及人工关节磨损颗粒诱导骨溶解中起重要作用[9-10]。RT-PCR结果显示，ERK特异性抑制剂（PD 98059）和JNK特异性抑制剂（SP 600125）可降低CoCrMo颗粒刺激下BMMs中IL-34的表达（P < 0.05）。Western blotting结果显示，CoCrMo颗粒虽然上调了IL-34的表达（P < 0.05），但也诱导了JNK和ERK的磷酸化；磷酸化的p38蛋白未见明显变化；ERK特异性抑制剂（PD 98059）和JNK特异性抑制剂（SP 600125）能显著降低其磷酸化蛋白的表达（P < 0.05）。说明CoCrMo颗粒可能通过ERK、JNK信号通路调控BMMs中IL-34的表达。见图 3。
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| A, p-p38 protein expression in each group after treatment with p38 signaling pathway inhibitor SB 202190;B, p-ERK protein expression in each group after treatment with ERK signaling pathway inhibitor PD 98059;C, treatment with JNK signaling pathway inhibitor SP 600125 after the expression of p-JNK protein in each group; D, RT-PCR to detect the relative expression of IL-34 mRNA in each group. # P < 0.05 vs Sham group. * P < 0.05 vs CoCrMo group. n = 3. 图 3 CoCrMo颗粒通过ERK和JNK信号通路调节BMMs中IL-34的表达 Fig.3 CoCrMo particles regulate the expression of IL-34 in BMMs through the ERK and JNK signaling pathways |
3 讨论
全关节置换术人工关节假体产生的磨损颗粒可刺激宿主的免疫细胞产生强烈的炎症反应，进而诱导骨溶解。磨损颗粒主要被巨噬细胞吞噬，产生各种炎性趋化因子和细胞因子[11]。假体周围骨溶解的病理生理机制尚未完全阐明，但越来越多的证据表明，钛（titanium，Ti）、聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）、超高分子量聚乙烯（ultra-high molecular weight polyethylene，UHMWPE）和钴铬等材料的磨屑导致了破骨细胞被过度激活[12-13]。而破骨细胞是体内唯一的骨吸收细胞。所以抑制破骨细胞的形成被认为是治疗无菌性松动的一个潜在新方向。体内破骨细胞受多种细胞因子的调节，RANKL和M-CSF被认为是协调破骨细胞分化和存活的2个关键因子[14]。M-CSF主要调节细胞黏附、分化、融合和吸收活性[15]；RANKL则致力于破骨细胞的融合、激活和存活[16]。RANKL和M-CSF代表着破骨细胞形成的典型途径。
有研究[17]报道了存在可以替代RANKL在体外促进破骨细胞生成的细胞因子，如TNF-α、IL-11和IL-8。然而，PARK等[18]发现RANKL基因敲除小鼠未能检测到TRAP阳性的未成熟或成熟的多核破骨细胞，故认为体内破骨细胞分化对RANKL的表达存在绝对依赖性。而M-CSF在体外和体内均可被血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）或肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）配体替代。ADAMOPOULOS等[19]还发现HGF可以替代M-CSF在体外刺激人破骨细胞的形成。IL-34是最近发现的一种细胞因子，它通过集落刺激因子-1受体作为髓系分化、增殖和存活的调节因子发挥作用。研究[3, 20]表明，IL-34不仅在调节破骨细胞生成中起重要作用，在体外和体内均能促进破骨细胞的骨吸收活性。本研究结果显示，IL-34在RANKL诱导的破骨细胞生成中起重要作用，可以替代M-CSF，支持破骨细胞分化，与M-CSF具有相同的作用。IL-34和RANKL的联合作用能够在体外诱导出多核破骨细胞。RT-PCR和ELISA结果显示，CoCrMo磨损颗粒呈时间和浓度梯度上调BMMs中IL-34的表达。因此，IL-34可能在磨损颗粒诱导的破骨细胞形成中起主导作用。EDA等[21]的研究结果证实，炎性细胞因子TNF-α和IL-1β能够通过ERK/JNK信号通路刺激破骨细胞前体细胞中IL-34的分泌。CoCrMo磨损颗粒已被证明可以激活MAPK信号通路。因此，本研究中利用Western blotting和RT-PCR进一步检测了CoCrMo刺激下BMMs中磷酸化p38、JNK、ERK和IL-34的表达水平。结果显示，CoCrMo磨损颗粒通过激活ERK/JNK信号通路上调了IL-34的表达，且ERK和JNK特异性信号通路抑制剂（PD 98059、SP 600125）能够相应地降低由磨损颗粒刺激下诱导的IL-34的表达水平。
研究证实，各种磨损颗粒是导致人工关节假体周围骨质溶解和继发性无菌性松动的主要原因，目前研究的磨损颗粒主要包括Ti、CoCrMo、UHMWPE、PMMA和骨水泥磨损颗粒。随着超高交联聚乙烯与陶瓷衬垫和生物固定概念的逐渐兴起，由PMMA和UHMWPE磨损颗粒引起的假体周围骨溶解有望在材料层面被解决[22]。然而，金属材质的磨损颗粒仍然是一个有待解决的问题。某些临床研究[23-25]证实了Ti和CoCrMo制成的金属对金属界面的人工关节假体较其他材料假体松动率和翻修率更高。LI等[26]研究证实，CoCrMo和Ti颗粒均可诱导体内的骨溶解，且CoCrMo颗粒可产生更强烈的炎性骨溶解反应。这也是本研究选用CoCrMo颗粒作为研究材料的原因之一。
综上所述，本研究证明了IL-34与M-CSF同样可以在体外诱导与RANKL共培养的破骨细胞的生成。此外，CoCrMo能通过ERK/JNK信号转导通路增强BMMs中IL-34的表达。提示IL-34在磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解中起重要作用，可能是未来治疗无菌性松动的一个潜在的新靶点。
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