支气管哮喘是一种常见的慢性气道炎症性疾病，主要特征为气道炎症、气道高反应和气道重塑^[1]。目前控制哮喘发作的主要药物是糖皮质激素，但已有研究^[2]表明，部分哮喘患者已出现了激素抵抗现象，且长期使用激素可能产生肥胖、高血压等不良反应。百令胶囊是由传统高原中药冬虫夏草经发酵制成^[3]，有研究^[4]报道百令胶囊对支气管哮喘有一定的治疗作用，而且与西药联合使用可降低激素用量、减少不良反应、有效控制症状。本研究旨在探讨百令胶囊对支气管哮喘小鼠气道炎症、气道重塑和气道高反应的治疗作用。

1 材料与方法 1.1 实验动物分组和哮喘模型制备

6~8周龄Balb/c雌性小鼠48只，体质量（20±3）g，按随机数字表法分为6组：正常对照组、支气管哮喘组、布地奈德组、低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组，每组8只。于实验第0、7、14天，分别给予支气管哮喘组、布地奈德组和低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组小鼠卵清蛋白（ovalbumin，OVA，20 μg）和氢氧化铝凝胶（2 mg）致敏。末次致敏7 d后，除正常对照组外，其余5组均以2% OVA（20 mg/mL）超声雾化（3 mL/min）进行激发实验，30 min/次，3次/周，共8周。每次激发实验前30 min，布地奈德组小鼠给予布地奈德（2 mg）雾化给药，低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组分别给予1.875 g/kg、3.75 g/kg、6.25 g/kg百令胶囊灌胃给药。正常对照组致敏和激发实验中药品均用生理盐水代替。

1.2 小鼠气道反应性测定

末次激发实验24 h后，应用emka小动物肺功能检测系统测定气道阻力。将小鼠放入密闭的体描箱中，给予不同浓度的乙酰胆碱（0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL）激发，采集增强呼气间歇（enhanced pause，Penh）值3 min，用于反映气道阻力。

1.3 支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）细胞计数

各组小鼠肺功能检测结束后，水合氯醛麻醉，行支气管肺泡灌洗，回收BALF并记录回吸收量，回吸收量 > 1.2 mL为合格标本。肺泡灌洗液4 ℃、1 200 r/min离心10 min，离心沉淀细胞用0.4 mL Hanks液重悬混匀，显微镜下计数BALF中细胞总数。

1.4 肺组织炎症、胶原沉积和杯状细胞观察

肺泡灌洗后取6组小鼠左肺组织进行石蜡包埋切片，分别行HE染色、AB-PAS染色、Masson染色。

1.4.1 HE染色

石蜡切片脱蜡至水，苏木素染色3~5 min，自来水冲洗5 min，室温下盐酸乙醇分化3 s，自来水冲洗30 min返蓝，伊红染液复染1~2 min，自来水轻度冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察比较各组小鼠肺组织炎症改变。

1.4.2 AB-PAS染色

石蜡切片脱蜡至水，阿利新蓝染色10~20 min，蒸馏水洗去浮色，0.5%高碘酸水溶液氧化5~10 min，蒸馏水洗去浮色，Schiff试剂染色15 min，流水冲洗10 min，苏木素染核5 min，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察气道上皮杯状细胞增生改变。

1.4.3 Masson染色

石蜡切片脱蜡至水，Weigert氏铁苏木素染色5 min，蒸馏水洗去浮色，1%盐酸乙醇分化数秒，流水冲洗数分钟返蓝。丽春红酸性品红液染色5~10 min，蒸馏水洗去浮色。磷钼酸水溶液处理约3~5 min，不用水洗，苯胺蓝液复染5 min，1%冰醋酸处理1 min。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察上皮下胶原沉积改变。

1.5 α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）免疫组织化学染色

采用SP法行肺组织α-SMA免疫组织化学染色。石蜡切片脱蜡至水，H₂O₂孵育5 min，微波炉抗原修复3次，6 min/次，10%胎牛血清常温封闭30 min，α-SMA一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜。二抗（1∶500）孵育60 min，显微镜下控制DAB显色，复染，脱水，透明，封片。

1.6 统计学分析

采用SPSS 24.0软件进行统计学分析。所有数据均用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法（方差齐时）、Dunnett’s T3法（方差不齐时），P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 百令胶囊抑制哮喘小鼠气道高反应

小鼠气道阻力与乙酰胆碱具有浓度依赖性。与支气管哮喘组相比，低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组小鼠气道阻力均明显降低（P < 0.05），与布地奈德组相似，说明百令胶囊能够有效缓解哮喘小鼠的气道高反应性。见表 1。

2.2 百令胶囊减少哮喘小鼠BALF中细胞总数

正常对照组、支气管哮喘组、布地奈德组、低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组小鼠BALF中细胞总数分别为（5.96±5.25）×10⁴/mL、（90.84±9.94）×10⁴/mL、（35.06±6.85）×10⁴/mL、（82.11±9.80）×10⁴/mL、（59.11±11.86）×10⁴/mL、（54.06±4.90）×10⁴/mL。支气管哮喘组BALF中细胞总数显著高于正常对照组（P < 0.05）。与支气管哮喘组相比，布地奈德组、低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组BALF中细胞总数均显著下降（P < 0.05）。且布地奈德组BALF中细胞总数低于低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组和高剂量百令胶囊组（P < 0.05）。

2.3 百令胶囊抑制小鼠气道炎症

HE染色结果显示，正常对照组小鼠气道周围无明显炎症细胞浸润；支气管哮喘组小鼠气道黏膜层及黏膜下层可见大量炎症细胞浸润；与支气管哮喘组相比，布地奈德组及低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组小鼠气道和血管周围炎症细胞浸润均明显减少，平滑肌增厚减轻。见图 1。

2.4 百令胶囊抑制哮喘气道黏液高分泌

AB-PAS染色结果显示，正常对照组小鼠气道上皮仅有少量PAS阳性细胞表达；支气管哮喘组PAS阳性细胞显著增加，气道黏液分泌增多；布地奈德组及低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组杯状细胞化生均减轻。见图 2。

2.5 百令胶囊抑制哮喘胶原沉积

Masson染色显示，支气管哮喘组小鼠气道黏膜中可见大量胶原纤维沉积，上皮下纤维化增加；与支气管哮喘组相比，布地奈德组及低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组上皮下纤维化、气道壁周围胶原沉积均明显减轻。见图 3。

2.6 百令胶囊抑制肺组织中α-SMA的表达

免疫组化染色结果显示，支气管哮喘组小鼠气道平滑肌层α-SMA表达水平显著增加，平滑肌增厚；与支气管哮喘组相比，布地奈德组及低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组小鼠肺组织内α-SMA表达均减少。见图 4。

3 讨论

支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，其病理特征是气道炎症、气道重塑和气道高反应^[5-6]。长期的炎症刺激和反复发作的喘息，导致气道高反应和气道结构改变^[7]。百令胶囊是由传统的高原中药冬虫夏草经发酵而形成，主要由甘露糖醇、虫草酸、生物碱、氨基酸等相关元素构成^[8]。有研究^[9]报道，百令胶囊在治疗支气管哮喘上有一定作用，能显著抑制嗜酸性粒细胞浸润和炎症的进展，减轻气道高反应，并且与西药联合应用可降低激素的用量，减轻不良反应，说明百令胶囊在治疗支气管哮喘上有一定的优势。本研究的目的是明确百令胶囊在支气管哮喘小鼠气道炎症、气道重塑和气道高反应中的作用。

本研究成功复制出具有典型气道炎症、气道重塑和气道高反应特征的慢性哮喘小鼠模型，发现百令胶囊可减少哮喘小鼠BALF中炎症细胞总数，缓解肺组织炎症细胞浸润和气管上皮杯状细胞化生，减少哮喘中黏液高分泌和上皮下纤维化。但与抗炎、抗气道重塑效果极佳的布地奈德相比，百令胶囊的上述治疗效果不如布地奈德理想，说明百令胶囊在治疗哮喘时抗炎、抗气道重塑作用有限。但值得注意的是，百令胶囊能显著抑制哮喘小鼠气道高反应，且效果不输于布地奈德，说明百令胶囊在抑制哮喘小鼠气道高反应上具有独特的疗效。

近年来，大量基础和临床研究表明，百令胶囊在治疗支气管哮喘上具有显著作用。有研究^[10]表明，百令胶囊可以调节支气管哮喘的免疫失衡，联合西药可快速改善急性发作期哮喘患者的临床症状，改善动脉血气，降低炎症水平，提高肺功能，从而提高临床治疗有效率。本研究也证明，百令胶囊可以抑制慢性哮喘小鼠气道炎症、气道高反应和气道重塑，尤其在治疗气道高反应上，百令胶囊与激素效果相当。

综上所述，百令胶囊在哮喘的治疗中可能发挥重要作用，未来有望作为哮喘治疗的药物。同时，百令胶囊联合激素治疗哮喘，可能改善患者的预后，减少不良反应。