骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是一组异质性很强的造血干细胞克隆性疾病，并具有高风险向白血病转化的特点，临床诊断和治疗均极为复杂。另外，由于早期MDS细胞形态改变不明显，临床表现隐匿，给这一部分患者的确诊及治疗带来难度。早期MDS诊断主要通过骨髓形态及染色体核型检测，随着二代测序技术的应用，基因突变谱系在MDS中的分布开始为临床诊疗提供依据。世界卫生组织2016版MDS修订分型亦将SF3B1基因突变纳入MDS伴环形铁粒幼红细胞增多（MDS-ring sideroblasts，MDS-RS）的诊断依据^[1]。随着研究的不断深入，会有更多的分子标记出现。本研究通过探索确诊MDS各类型以及确诊与疑似MDS间基因突变差异，为MDS的诊断及分型提供分子依据。

1 材料与方法 1.1 临床资料

选取2015年8月至2019年12月就诊于我院的201例确诊MDS患者及87例疑似MDS患者骨髓标本。所有入组确诊及疑似MDS患者均符合2019年版中国MDS诊断和治疗指南^[2]的相应标准。MDS确诊患者的分型参照2016年WHO分型标准，包括MDS伴原始细胞增多（MDS-excess blasts，MDS-EB）、MDS伴单系病态（MDS-single lineage dysplasia，MDS-SLD）、MDS伴多系病态（MDS-multilineage dysplasia，MDS-MLD）、MDS-RS以及MDS未分型（MDS-unclassifiable，MDS-U）。患者一般临床资料见表 1。

1.2 骨髓单个核细胞处理及样本检测

将抗凝骨髓离心取单个核细胞于细胞裂解液（天根生化科技北京有限公司）中，混匀后静置裂解10 min，并离心留取单个核细胞沉淀。应用过柱法（天根生化科技北京有限公司）提取DNA以备下一步测序。

1.3 二代测序检测基因突变

应用MDS基因突变二代测序检测试剂（上海源奇生物医药科技有限公司），测序深度3 000源。所检测基因中包括2019年专家指南中的必检基因（SF3B1），推荐的选做基因（RUNX1，ASXL1，DNMT3A，IDH1，IDH2，NRAS，SETBP1，SRSF2，TET2，TP53，U2AF1，EZH2，ZRSR2）以及MDS中常见的其他突变基因（JAK2，ETV6）共17个。按功能分类，这17个基因涉及RNA剪切、DNA甲基化、组蛋白修饰、转录因子、肿瘤抑制因子、信号转导通路等6大功能，在MDS发生发展转归中起重要作用。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析。描述性数据分析应用中位数、最大值、最小值相结合的方法。多独立样本两两比较及总体比较应用Mann-Whitney U检验及Kruskal-Wallis H检验进行。计数资料的比较应用χ²检验。P < 0.05为差异有统计学意义。在本研究中，由于纳入的MDS-U患者仅2例，容易在统计计算中造成系统误差，因此所有涉及确诊患者各类型间统计的计算均未涉及MDS-U这一类型。

2 结果 2.1 患者一般资料分析

纳入研究的201例确诊及87例疑似MDS患者在年龄（P = 0.289）及性别（P = 1.000）方面差异无统计学意义，同时在确诊的3类MDS患者间，年龄（P = 0.905）及性别（P = 0.616）的差异也无统计学意义。进一步将确诊患者按年龄分为3组：青少年组（< 30岁，13例），中年组（30~ < 60岁，83例）和老年组（≥60岁，103例）。结果显示，好发于老年组的基因突变为SF3B1、ASXL1；好发于青少年组的基因突变为ETV6、SETBP1；而TP53基因突变仅发生于中年组及老年组，老年组的突变比例更高。同时，在疑似MDS患者中比较3个年龄组间基因突变差异，无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。

2.2 确诊MDS患者突变基因频次分析

在201例确诊患者中，发生基因突变的患者149例（74.1%）。在确诊的各类型患者之间，突变阳性率的差异均存在统计学意义（P = 0.041）。确诊患者中突变频率最高的5种基因分别为ASXL1、TP53、U2AF1、SF3B1和TET2。MDS-EB患者突变频率最高的5种基因分别为ASXL1、TP53、U2AF1、RUNX1和DNMT3A，MDS-SLD/MLD患者为ASXL1、U2AF1、TP53、SF3B1、TET2，MDS-RS患者为SF3B1、TET2、ASXL1、TP53、DNMT3A。在突变个数方面，确诊患者各类型之间差异无统计学意义（P = 0.189），见表 3。

具体分析17个基因的分布，发现SF3B1（P < 0.001）、TET2（P = 0.002）在组间的差异存在统计学意义。由于以上2个基因运用的是多样本差异检验，进一步进行了3种MDS类型间针对SF3B1和TET2基因的两两比较，显示TET2的组间差异主要表现在MDS-EB与MDS-RS之间（P < 0.001），而SF3B1的组间差异则分别表现于MDS-EB与MDS-RS（P < 0.001）、MDS-SLD/MLD与MDS-RS（P < 0.001）之间，提示与MDS-EB相比TET2突变更好发于MDS-RS患者，而SF3B1在MDS-RS中的突变频率亦显著高于另外两型。在按功能分类的基因突变比较中，确诊患者各类型间RNA剪接功能差异明显（P < 0.001）。

2.3 确诊及疑似MDS患者间基因突变差异分析

在确诊及疑似MDS患者间，发生基因突变阳性的确诊患者149例（74.1%），疑似MDS患者31例（35.6%），突变阳性率的差异存在统计学意义（P < 0.001），确诊MDS患者基因突变阳性率高于疑似患者。疑似病例突变频率最高的5种基因分别为ASXL1、U2AF1、SF3B1、TET2、DNMT3A。在突变个数方面，确诊患者与疑似患者间差异有统计学意义（P < 0.001），提示确诊MDS患者发生基因突变的个数更多，见表 3。

进一步比较确诊MDS与疑似MDS间的基因分布差异，发现ASXL1（P = 0.024）、NRAS（P = 0.035）和TP53（P = 0.001）3个基因在组间的差异存在统计学意义，其中NRAS突变仅发生于确诊MDS，ASXL1与TP53基因在确诊患者中的突变频率也显著高于疑似病例，提示该3个基因与MDS相关。

2.4 确诊MDS染色体分层与基因突变分析

本研究共收录的确诊MDS患者，除去未进行染色体检测及染色体无分裂像患者35例，参照IPSS-R预后分层原则，将166例确诊MDS患者预后分为极好（1例）、好（119例）、中等（22例）、差（7例）和极差（17例）5级。分析各风险水平MDS患者的基因突变情况，由于极好组缺乏统计学资料，因此下列比较仅讨论其他4组。在突变个数方面，各组间差异无统计学意义。各组间IDH2（P = 0.009）、TP53（P < 0.001）突变频率的差异存在统计学意义。IDH2基因突变在预后差组的发生频率显著高于其他组，而TP53基因在预后极差组的发生频率显著高于其他组，见表 4。

3 讨论

随着二代测序技术的高速发展，多种对MDS具有诊断、预后判断、指导治疗意义的基因不断涌现。MDS多发于老年，其造血细胞克隆性异常与MDS的发病相关^[3]。本研究发现SF3B1、ASXL1突变好发于老年，ETV6、SETBP1突变好发于青年，而TP53突变仅出现于中老年。研究^[4-5]指出血液系统恶性肿瘤中DNMT3A、ASXL1、TET2基因突变的发生率随年龄增长而显著上升，与本研究结果相符。目前尚无文献报道ETV6突变的年龄趋势，但ETV6可通过对细胞进行剪接调控参与MDS的发生，而剪接调控是导致衰老的重要因素，提示ETV6基因是年龄相关致病因子^[6]。SETBP1基因突变可见于多种血液病^[7]，MAKISHIMA等^[8]在对急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）患者的分析中发现该突变多发于老年，与本研究结果不一致，可能是由于AML恶性程度更高，年龄的累积负荷更大。也不除外人种及样本量造成的差异。TP53是重要的抑癌基因，本研究发现TP53突变在MDS中存在年龄差异。多项研究^[9-11]证实该基因突变在血液系统恶性肿瘤中呈现高龄突变趋势，与本研究结果相符。

本研究发现确诊MDS类别间存在突变差异。SF3B1、TET2在MDS-RS组突变率更高。有文献^[12-13]报道TET2突变与正常核型相关，MDS-RS患者多为正常核型，而MDS-EB患者多伴核型异常，提示与TET2的正常核型关联性存在某种内在联系。目前针对MDS的基因突变极少涉及类别间差异研究，本研究虽然样本量较小，但也可为类别研究提供探索性思路。

本研究结果显示，MDS患者不同核型组的突变基因存在差异。IDH2突变好发于预后差组，而TP53基因在预后极差组的突变率更高。有研究^[14]发现7.2%MDS患者伴TP53突变，且与复杂核型、预后高危及中位总生存期短相关，与本研究一致。对于IDH2基因的在MDS中的研究一直存在争议，部分研究者认为IDH2突变的MDS患者具有更短的总生存期和无病生存期，预后不良。也有研究^[15-16]证明IDH2与MDS的风险评估及预后关系不明。本研究结果显示，IDH2突变更易发生于核型差的预后分组，这为IDH2的预后不良假说提供了支持。

通过疑似与确诊MDS患者的突变比对，发现ASXL1、NRAS、TP53基因在确诊患者中的突变率明显高于疑似患者，其中NRAS突变仅发生于确诊患者。LINDSLEY等^[17]发现ASXL1、TP53、DNMT3A、TET2和RUNX1是MDS最为常见的5种基因突变，与本研究部分相符。而NRAS基因突变虽常见于粒单核细胞白血病，但在诊断MDS时，当存在一定的形态学证据，却不完全符合MDS的诊断标准时，NRAS突变可提供支持性证据^[18]。上述发现提示这种确诊患者的倾向性突变可能应用于MDS的辅助诊断，为疑似患者的确诊提供帮助。

综上，本研究结果显示，MDS患者的基因突变存在年龄、分型及危险分层差异，而确诊MDS与疑似患者之间也存在明显突变差异，这将为MDS的诊断、分型及预后判断提供帮助。