中国医科大学学报  2021, Vol. 50 Issue (2): 116-123

文章信息

王奕丹, 王一涵, 黄钰雯, 阴迪, 于运, 刘丽梅
WANG Yidan, WANG Yihan, HUANG Yuwen, YIN Di, YU Yun, LIU Limei
DNA甲基转移酶3b对乳腺癌细胞微小RNA表达的影响
Effect of DNA methyltransferase 3b on microRNA expression in breast cancer cells
中国医科大学学报, 2021, 50(2): 116-123
Journal of China Medical University, 2021, 50(2): 116-123

文章历史

收稿日期:2020-04-30
网络出版时间:2021-01-13 15:56
DNA甲基转移酶3b对乳腺癌细胞微小RNA表达的影响
北华大学医学技术学院实验中心, 吉林 吉林 132013
摘要目的 通过DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)与siRNA干扰改变乳腺癌细胞MCF-7中DNA甲基化水平,探讨DNA甲基转移酶3b(Dnmt3b)表达对乳腺癌细胞相关mRNA、微小RNA(miRNA)的影响。方法 通过5-Aza-CdR抑制乳腺癌细胞整体甲基化水平,免疫荧光染色检测其抑制效果,高通量测序检测乳腺癌细胞miRNA的表达,荧光定量PCR(qRT-PCR)检测乳腺癌细胞miRNA及乳腺癌相关基因的表达;通过siRNA干扰抑制乳腺癌细胞中Dnmt3b的表达,qRT-PCR和Western blotting检测siRNA干扰效率,细胞生长曲线反映细胞生长情况。结果 5-Aza-CdR降低细胞整体甲基化水平,siRNA干扰后Dnmt3b的表达下降,细胞生长显著抑制;高通量测序显示5-Aza-CdR作用后67个miRNA表达有统计学差异(均P < 0.05);qRT-PCR结果显示5-Aza-CdR作用后乳腺癌细胞中miR-200a、miR-411、miR-382、miR-409、miR-493、miR-127、miR-520a、miR-654表达显著上调(P < 0.05);siRNA干扰Dnmt3b后乳腺癌细胞中miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-203b、miR-409、miR-520a、miR-654的表达显著上调(P < 0.05),而miR-200b、miR-127的表达显著下调(均P < 0.05);5-Aza-CdR作用后乳腺癌细胞WWOXMMP7的表达下调,TCF21TIMP1的表达上调(均P < 0.05);siRNA干扰Dnmt3b后乳腺癌细胞抑癌基因BRCA1BRCA2及癌基因MMP7survivin的表达均下调(均P < 0.05)。结论 Dnmt3b可影响乳腺癌细胞相关基因WWOXTCF21BRCA1BRCA2MMP7TIMP1PKM2survivin及miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-200b、miR-203b、miR-409、miR-127、miR-520a、miR-654的表达。
关键词DNA甲基转移酶3b    乳腺癌    微小RNA    
Effect of DNA methyltransferase 3b on microRNA expression in breast cancer cells
Experiment Center, Medical Technology College, Beihua University, Jilin 132013, China
Abstract: Objective 5-Aza-2'-deoxycytidine (5-Aza-CdR), a methyltransferase inhibitor, and siRNA interference were used to explore the effect of DNA methyltransferase 3b (Dnmt3b) expression to study mRNA and microRNA (miRNA) expression landscape in breast cancer. Methods 5-Aza-CdR was used to inhibit methylation of MCF-7 breast cancer cells, and its effects were evaluated using immunofluorescence staining. High-throughput sequencing and quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) were performed to detect and assess the expression of miRNA and breast cancer-related genes, respectively. siRNA interference was used to inhibit Dnmt3b expression in breast cancer cells, and its impact on cell growth and miRNA and breast cancer-related gene expression were evaluated. Results Addition of 5-Aza-CdR reduced the methylation levels of the cells, as well as the expression of Dnmt3b. Cell growth was significantly inhibited by siRNA interference. High-throughput sequencing revealed 67 miRNAs whose expression levels were significantly altered after 5-Aza-CdR treatment (P < 0.05). Particularly, expression levels of miR-200a, miR-411, miR-382, miR-409, miR-493, miR-127, miR-520a, and miR-654 were significantly upregulated in breast cancer cells (all P < 0.05). Moreover, expression levels of miR-29b, miR-506, miR-200a, miR-203b, miR-409, miR-520a, and miR-654 were significantly upregulated upon Dnmt3b knockdown, whereas those of miR-200b and miR-127 were significantly downregulated (all P < 0.05). WWOX and MMP7 levels were downregulated in breast cancer cells in the presence of 5-Aza-CdR, whereas those of TCF21 and TIMP1 were upregulated (all P < 0.05). Furthermore, Dnmt3b knockdown led to the expression of the BRCA1 and BRCA2 tumor suppressors, and the downregulation of MMP7 and surviving oncogenes. Conclusion Dnmt3b affects the expression of breast cancer cell-related genes WWOX, TCF21, BRCA1, BRCA2, MMP7, TIMP1, PKM2, survivin, and miR-29b, miR-506, miR-200a, miR-200b, miR-203b, miR-409, miR-127, miR-520a, and miR-654.
Keywords: DNA methyltransferase 3b    breast cancer    microRNA    

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,死亡率高,严重危害女性健康。乳腺癌的发生发展常受到多种基因的调控(原癌基因的激活和抑癌基因的失活),同时也受到一些表观遗传学因素[DNA甲基化和微小RNA(microRNA,miRNA)等]影响[1-3]。其中DNA甲基化的发生不仅可以影响肿瘤相关基因的表达变化,而且对位于CpG岛附近或位于CpG岛中的miRNA表达产生影响[4-6]。本研究探讨抑制DNA甲基化和siRNA干扰DNA甲基转移酶3b(DNA methyltransferase 3b,Dnmt3b)后乳腺癌细胞MCF-7中miRNA和肿瘤相关基因的表达情况,旨在为乳腺癌的诊断和治疗提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料

人乳腺癌细胞株MCF-7购自中国科学院上海细胞生物学研究所,DMEM培养液、胎牛血清和胰蛋白酶购于美国HyClone公司,转染试剂购于美国QIAGEN公司,RNA提取、反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购于日本TaKaRa BIOINC公司,GAPDH抗体、DNA甲基化抗体购于英国Abcam公司,二抗购于中国博士德公司,抗荧光淬灭剂、Hoechst33258购于德国Sigma公司。siRNA由上海吉玛公司合成,引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫荧光染色检测MCF-7细胞甲基化水平

将盖玻片过酸处理高压灭菌后,放入24孔板中,接种MCF-7细胞,24 h后实验组分别加入5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR),终浓度分别为5-Aza-CdR 10、5、1 μmol/mL;对照组加入等体积PBS,每24 h加入1次5-Aza-CdR,同时更换培养液,连续处理4 d。4 d后取出盖玻片,PBS清洗3次,用5%多聚甲醛固定30 min,PBS清洗3次。用TritonX-100(0.2%)透化40 min,盐酸(4N)酸化30 min,弃去液体后,用Tris盐酸(pH8.0)中和20 min,PBS清洗3次。BSA(1%)4 ℃封闭过夜后,加入适量5-甲基胞嘧啶直接荧光抗体(1%BSA 1:50稀释),避光放置4 ℃过夜,PBS清洗3次,每次30 min。在适量Hoechst33258染色液(5 mg/L)中避光染色10 min,PBS避光清洗3次,每次5 min。将含抗荧光淬灭剂的封片剂DABCO滴于载玻片上封片,30 min内荧光倒置显微镜下观察,拍照并记录。

1.2.2 siRNA转染及细胞生长曲线绘制

MCF-7细胞用含有10%胎牛血清和90%DMEM培养液,置于37 ℃、5%CO2中培养。实验分为空白对照组(Mock组)、阴性对照组(NC组)和干扰组(siRNA组)。针对Dnmt3b的siRNA-1511及其阴性对照序列如下:5’-CGCCUCAAGACAAAUUGCUTT-3 ’;5’-AGCAAUUUGUCUUGAGGCGTT-3’。转染前1 d将细胞按照1×105/mL接种于24孔板中,每孔加入1 mL培养液。过夜贴壁后,每孔更换为400 μL无血清培养液待用。用100 μL无血清培养液稀释80 ng siRNA,与3 μL转染试剂混匀,室温静止5~10 min,轻轻将转染复合物滴加至24孔板中,轻轻摇匀,转染6 h后荧光显微镜下观察转染情况,计算转染效率。48 h后提取RNA检测目的基因表达情况,96 h后检测miRNA与相关基因表达情况。转染前后连续5 d显微镜下计数细胞,绘制细胞生长曲线。

1.2.3 qRT-PCR检测siRNA干扰后细胞Dnmt3b mRNA的表达

转染48 h后提取NC组、Mock组、siRNA组细胞RNA逆转录,获得的cDNA进行qRT-PCR扩增Dnmt3b mRNA,β-actin作为内参,采用2-ΔΔCt法进行数据分析,引物序列见表 1

表 1 引物序列 Tab.1 Sequences of the primers used in the study
Gene Forward primer(5’-3’) Reverse primer(5’-3’)
Dnmt3b CCCATTCGAGTCCTGTCATT GGTTCCAACAGCAATGGACT
WWOX GCAGTGCATCCTGGAAATATGAT CAGTTGTTGAAGTACATCCCTCC
TCF21 TTCATCCACCTGTCTATTTGCAC CCTCTGGTAGAAAGGAGAGAACA
BRCA1 TATGGGCCCTTCACCAACAT AAGCCATTGTCCTCTGTCCA
BRCA2 CTCAGCGTTTGTGTATCGGG CTCCCACCTCAGCTTCTCAA
Survivin ACCTGAAAGCTTCCTCGACA TTCCCAGACTCCACTCCAAC
MMP7 AATGTTAAACTCCCGCGTCATAG AAGCCTTTGACACTAATCGATCC
TIMP1 GACCACCTTATACCAGCGTTATG TTTCCAGCAATGAGAAACTCCTC
PKM2 GAGCAGGATGTTGATATGGTGTT CAGGATTTCATCAAACCTCCGAA
β-actin CACCTTCACCGTTCCAGTTT GATGAGATTGGCATGGCTTT

1.2.4 Western blotting检测siRNA干扰后细胞Dnmt3b蛋白的表达

收集Mock组、NC组、siRNA组细胞,加入RAPI细胞裂解液,4℃裂解10 min,其间涡旋振荡2次,30 s/次,4℃离心15 min,取上清,BCA法测定蛋白浓度。调蛋白浓度一致,进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,半干法转膜。封闭后加入Dnmt3b单克隆抗体(1:100稀释),内参加入兔抗-GAPDH抗体(1:200稀释),慢摇1 h,用PBS-T洗膜3次,每次20 min。加入二抗(Dnmt3b 1:3 000稀释;GAPDH 1:2 000稀释),室温孵育40 min,PBS-T洗膜1次,PBS洗膜2次,每次10 min。在显影仪中滴加显影液显影,用Image J软件对蛋白表达条带进行光密度值的定量分析。

1.2.5 高通量测序检测miRNA的表达情况

将细胞按1×105/mL接种于6孔板,每孔加入含10%胎牛血清的DMEM,3孔/组,分为实验组和对照组,实验组每孔加入终浓度5 μmol/mL的5-Aza-CdR,换液1次/24 h,并重新加入5-Aza-CdR。72 h后每孔加入1 mL Trizol将细胞完全裂解,miRNA高通量测序委托上海吉玛公司进行。

1.2.6 qRT-PCR检测mRNA和miRNA的表达

采用Trizol法提取RNA,检测浓度与质量,进行逆转录,qRT-PCR扩增,退火温度及引物序列见表 1表 2。以β-actin为内参,采用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。

表 2 miRNA引物序列 Tab.2 Sequences of the primers targeting miRNA sequences used in the study
miRNA Sequences of the primers
miR-29c CTTGTGGTCCTCTTTAGCCAGT
miR-125b GCTCCCTGAGACCCTAACTTGTGA
miR-21 GCGCTAGCTTATCAGACTGATGTTGA
miR-26b GCGCTTCAAGTAATTCAGGATAGGT
miR-29b GCGCTAGCACCATTTGAAATCAGTGTT
miR-155 GGCTTAATGCTAATCGTGATAGGGGT
miR-506 GCTAAGGCACCCTTCTGAGTAGA
miR-145 GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT
miR-200a GCGCTAACACTGTCTGGTAACGATGT
miR-203a GCGGTGAATGTTTAGGACCACTAG
miR-200b CATCTTACTGGGCAGCATTGGA
miR-411 GCTATGTAACACGGTCCACTAACC
miR-382 CGCGAATCATTCACGGACAACACTT
miR-409 GAATGTTGCTCGGTGAACCCCT
miR-493 TGAAGGTCTACTGTGTGCCAGG
miR-127 TCGGATCCGTCTGAGCTTGGCT
miR-520a GCAAAGTGCTTCCCTTTGGACTGT
miR-654 GCTATGTCTGCTGACCATCACCTT

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0统计学软件进行统计处理。计量资料用x±s表示,组间比较采用t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 5-Aza-CdR对细胞DNA甲基化水平的影响

荧光显微镜观察MCF-7甲基化程度,结果可见,随着5-Aza-CdR浓度的升高,5-甲基胞嘧啶甲基化抗体染色逐渐减弱,表示其整体甲基化水平逐渐降低。与对照组(59.37±8.45)比较,1、5、10 μmol/mL组(分别为34.30±9.47、5.11±2.78、4.99±2.64)甲基化水平均有统计学差异(均P < 0.05),但5 μmol/mL组与10 μmol/mL组比较差异无统计学意义(P > 0.05),因此后续实验选用5 μmol/mL浓度5-Aza-CdR,见图 1

5-methylcytosine antibody was labeled green, and hoechst 33258 labeled cell nucleus was blue. 图 1 5-Aza-CdR处理后细胞DNA甲基化水平的改变×400 Fig.1 Changes in DNA methylation levels in cells after 5-Aza-2'-deoxycytidine (5-Aza-CdR) treatment ×400

2.2 siRNA转染后细胞生长及Dnmt3b的表达

Western blotting结果显示,siRNA干扰组中Dnmt3b的表达低于Mock组和NC组(P < 0.05),见图 2A2B。qRT-PCR结果显示,与对照组比较,siRNA干扰组Dnmt3b的表达显著下降(P < 0.05),抑制达75%以上,见图 2C;细胞计数可见Mock组和NC组细胞生长速度相近,而与Mock组和NC组比较,siRNA干扰组细胞生长受到抑制(P < 0.05),见图 2D。说明siRNA转染后显著下调Dnmt3b的表达。

A, B, the expression of Dnmt3b;C, the expression of Dnmt3b mRNA; D, cell growth curve. mock, mock group; NC, negative control group; siRNA, siRNA interference group.*P < 0.05 vs mock or NC groups. 图 2 siRNA干扰后细胞生长及Dnmt3b的表达 Fig.2 Cell growth and DNMT3b expression after siRNA interference

2.3 5-Aza-CdR处理、Dnmt3b siRNA干扰后癌基因和抑癌基因mRNA的表达

与对照组比较,经5 μmol/mL 5-Aza-CdR处理后WWOXMMP7表达显著下调,TCF21TIMP1表达显著上调,差异均有统计学意义(P < 0.05),见表 3。与NC组比较,siRNA干扰组抑癌基因BRCA1BRCA2及癌基因MMP7survivin的表达均显著下调(均P < 0.05),见表 3

表 3 5-Aza-CdR处理及Dnmt3b siRNA干扰后癌基因和抑癌基因mRNA的表达 Tab.3 Relative mRNA expression of oncogenes and tumor suppressors after 5-Aza-2'-deoxycytidine (5-Aza-CdR) treatment and DNMT3b siRNA interference
Group WWOX mRNA TCF21 mRNA BRCA1 mRNA BRCA2 mRNA MMP7 mRNA TIMP1 mRNA PKM2 mRNA survivin mRNA
Control 1.00±0 1.00±0 1.00±0 1.00±0 1.00±0 1.00±0 1.00±0 1.00±0
5-Aza-CdR 0.54±0.031) 2.44±0.101) 1.14±0.04 0.99±0.09 0.59±0.031) 1.45±0.131) 0.87±0.02 1.01±0.04
Mock 1.00±0 1.00±0 1.00±0 1.00±0 1.00±0 1.00±0 1.00±0 1.00±0
NC 0.69±0.15 0.21±0.05 0.96±0.04 1.07±0.03 1.30±0.45 0.55±0.01 0.30±0.04 1.18±0.04
siRNA 0.59±0.09 0.34±0.04 0.62±0.012) 0.48±0.012) 1.08±0.302) 0.50±0.07 0.25±0.01 0.76±0.022)
1)P < 0.05 vs control group;2) P < 0.05 vs NC group.

2.4 高通量测序检测5-Aza-CdR处理后miRNA的表达情况

高通量测序结果显示,1 319个miRNA表达存在差异,其中,67个miRNA表达有统计学差异(均P < 0.05),见图 3。20个miRNA实验组与对照组均有表达,见表 4;47个miRNA对照组中无表达,见表 5

A, 5-Aza-CdR treatment group; B, control group. 图 3 5-Aza-CdR处理后MCF-7 miRNA高通量测序差异表达 Fig.3 Identification of differentially expressed miRNAs after 5-Aza-2'-deoxycytidine (5-Aza-cdR) treatment

表 4 高通量测序中miRNA差异表达 Tab.4 Differential expression of miRNAs determined via high-throughput sequencing
miRNA Difference(log2) P
hsa-miR-127-3p 10.331 30 2.48E-16
hsa-miR-1-3p 1.857 62 0.006 858
hsa-miR-151a-5p 1.369 14 0.027 241
hsa-miR-199a-3p 3.738 95 0.002 406
hsa-miR-199b-3p 3.721 02 0.002 591
hsa-miR-199b-5p 2.044 34 0.047 962
hsa-miR-200a-3p 3.803 98 3.88E-06
hsa-miR-200a-5p 4.342 51 0.001 181
hsa-miR-200b-3p 4.239 78 8.23E-10
hsa-miR-200c-3p 1.786 00 0.030 173
hsa-miR-203b-3p 3.381 54 0.005 214
hsa-miR-323a-3p 6.231 99 0.003 510
hsa-miR-375 6.120 20 3.40E-05
hsa-miR-379-5p 7.553 91 5.04E-07
hsa-miR-381-3p 7.721 02 2.22E-05
hsa-miR-429 4.486 56 0.000 489
hsa-miR-494-3p 6.721 02 0.000 952
hsa-miR-518b 5.257 08 0.024 202
hsa-miR-654-3p 6.465 19 0.001 949
hsa-miR-889-3p 6.738 95 0.000 902

表 5 高通量测序中对照组不表达的miRNA Tab.5 List of miRNAs not expressed in the control group as determined via high-throughput sequencing
miRNA P
hsa-miR-1185-1-3p 0.029 278
hsa-miR-127-5p 0.007 737
hsa-miR-1323 0.000 131
hsa-miR-134-5p 0.002 422
hsa-miR-136-3p 0.011 924
hsa-miR-199a-5p 1.77E-05
hsa-miR-202-5p 0.047 847
hsa-miR-299-3p 0.047 847
hsa-miR-3180-3p 0.047 847
hsa-miR-323b-3p 0.032 912
hsa-miR-329-3p 0.042 233
hsa-miR-363-3p 0.014 315
hsa-miR-369-3p 0.006 553
hsa-miR-370-3p 3.74E-06
hsa-miR-372-3p 0.007 117
hsa-miR-373-3p 0.019 113
hsa-miR-517b-3p 0.002 798
hsa-miR-517c-3p 0.015 728
hsa-miR-518e-5p 0.047 847
hsa-miR-519d-3p 0.015 728
hsa-miR-520a-3p 0.000 163
hsa-miR-520a-5p 0.047 847
hsa-miR-520c-3p 0.029 278
hsa-miR-520g-3p 0.007 117
hsa-miR-382-3p 0.004 065
hsa-miR-382-5p 0.005 139
hsa-miR-409-3p 8.02E-06
hsa-miR-409-5p 0.010 909
hsa-miR-410-3p 0.042 233
hsa-miR-411-3p 0.029 278
hsa-miR-411-5p 0.001 709
hsa-miR-485-3p 0.037 202
hsa-miR-493-3p 0.002 798
hsa-miR-493-5p 5.16E-05
hsa-miR-495-3p 0.023 486
hsa-miR-498 0.010 909
hsa-miR-512-3p 3.91E-07
hsa-miR-515-5p 0.013 054
hsa-miR-516b-5p 0.002 256
hsa-miR-517a-3p 0.001 829
hsa-miR-523-5p 0.047 847
hsa-miR-526b-5p 0.001 306
hsa-miR-543 0.000 300
hsa-miR-654-5p 0.009 167
hsa-miR-655-3p 0.032 912
hsa-miR-665 0.032 912
hsa-miR-758-3p 0.013 054

2.5 qRT-PCR检测5-Aza-CdR处理、Dnmt3b siRNA干扰后miRNA的表达情况

与对照组比较,经5 μmol/mL 5-Aza-Cdr处理后miR-200a、miR-411、miR-382、miR-409、miR-493、miR-127、miR-520a、miR-654表达量显著上调(P < 0.05),并且此8个miRNA的差异性表达与高通量测序结果一致。与NC组比较,siRNA干扰组中miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-203b、miR-409、miR-520a、miR-654的表达显著上调,而miR-200b、miR-127的表达显著下调(均P < 0.05),见表 6

表 6 5-Aza-CdR处理及Dnmt3b siRNA干扰后miRNA的表达 Tab.6 Relative expression levels of miRNA after 5-Aza-2'-deoxycytidine (5-Aza-CdR) treatment and DNMT3b siRNA interference
miRNA Control group 5-Aza-Cdr group Mock group NC group siRNA group
miR-29c 1.00±0 0.52±0.06 1.00±0 1.98±0.60 1.54±0.78
miR-125b 1.00±0 0.22±0.02 1.00±0 0.95±0.21 0.77±0.10
miR-21 1.00±0 0.29±0.07 1.00±0 0.87±0.07 0.87±0.09
miR-26b 1.00±0 0.22±0.03 1.00±0 1.00±0.16 1.02±0.09
miR-29b 1.00±0 0.45±0.15 1.00±0 0.67±0.09 1.04±0.102)
miR-155 1.00±0 0.42±0.06 1.00±0 1.44±0.19 1.67±0.30
miR-506 1.00±0 0.47±0.05 1.00±0 0.53±0.06 0.91±0.152)
miR-145 1.00±0 0.55±0.12 1.00±0 1.49±0.31 1.37±0.34
miR-200a 1.00±0 7.03±0.331) 1.00±0 1.24±0.25 2.32±0.552)
miR-203b 1.00±0 0.26±0.07 1.00±0 1.27±0.29 1.64±0.502)
miR-152 1.00±0 0.23±0.05 1.00±0 0.70±0.33 0.77±0.20
miR-203a 1.00±0 0.33±0.02 1.00±0 1.18±0.13 1.14±0.10
miR-200b 1.00±0 0.27±0.05 1.00±0 1.18±0.08 0.72±0.152)
miR-411 1.00±0 22.37±1.461) 1.00±0 0.06±0.01 0.03±0.12
miR-382 1.00±0 13.90±0.491) 1.00±0 1.36±0.11 1.69±0.17
miR-409 1.00±0 7.71±0.541) 1.00±0 1.24±0.05 3.45±0.212)
miR-493 1.00±0 7.23±0.781) 1.00±0 2.01±0.11 2.27±0.04
miR-127 1.00±0 3.49±0.251) 1.00±0 1.45±0.07 0.91±0.232)
miR-520a 1.00±0 8.86±0.761) 1.00±0 0.02±0.00 0.95±0.062)
miR-654 1.00±0 4.89±0.381) 1.00±0 0.10±0.01 0.59±0.082)
1)P < 0.05 vs control group;2)P < 0.05 vs NC group.

3 讨论

miRNA来源于细胞核内基因组的miRNA基因,部分miRNA位于CpG岛附近或位于CpG岛中,这些miRNA表达极易受到DNA异常甲基化的调控[7-9]。miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关,尽管完整的miRNA表达调控机制目前尚不清楚,但已有研究提示肿瘤细胞中DNA甲基化异常会引起miRNA表达改变。HASHIMOTO等[10]研究显示胃癌组织和细胞中miR-181c基因CpG岛高甲基化,而miR-181c低表达,经5-Aza-CdR处理后miR-181c表达恢复,同时抑制了胃癌细胞增殖。在DNA甲基化过程中,DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,Dnmt)参与催化,其包含Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b等,其中Dnmt3b参与CpG从头甲基化[11]。有研究[7]表明乳腺癌组织中Dnmt3b表达增加,并且与肿瘤分期及预后相关。本研究通过5-Aza-CdR抑制乳腺癌细胞整体甲基化水平,结果显示,miR-200a、miR-411、miR-382、miR-409、miR-493、miR-127、miR-520、miR-654的表达显著上调,而仅干扰Dnmt3b表达时,miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-203b、miR-409、miR-502a、miR-654表达显著上调,miR-127、miR-200b表达显著下调,此结果与高通量测序结果基本一致。有研究[13-14]表明miR-29家族可调控Dnmt3a和Dnmt3b的表达。由此可见,Dnmt3b会受到miRNA的调控,也可以改变部分miRNA基因甲基化状态,从而影响它们的转录表达。

乳腺癌的发生发展与癌基因的表达增高和抑癌基因的沉默密切相关,Dnmt3b作为甲基化的催化剂可以影响部分基因表达的功能。已有研究表明,在癌组织中抑癌基因WWOXTCF21BRCA1BRCA2[15-20]表达下降,而癌基因MMP7[21]TIMP1[22]PKM2[23]survivin[24]表达增高。本研究中5-Aza-CdR可以使乳腺癌细胞中抑癌基因WWOX和癌基因MMP7表达降低,而上调抑癌基因TCF21和癌基因TIMP1,其中TCF21MMP7的表达符合预期结果,而WWOXTIMP1的结果分析原因可能是由于转录后调控影响这些基因的表达。对于siRNA干扰抑制Dnmt3b的表达中可见癌基因TIMP1PKM2survivin的表达显著降低,而抑癌基因WWOXTCF21BRCA1BRCA2的表达也降低,分析原因可能是由于甲基化程度与组织特异性的关系存在多样化,虽然这些基因在前列腺癌、肺癌、大肠癌甚至乳腺癌中甲基化程度较高,但实验中所培养的细胞种类不同、肿瘤的分期进展不同、肿瘤的组织种类不同,其甲基化水平也不相同。另外本研究仅对Dnmt3b进行干扰抑制Dnmt3b的表达,推测Dnmt3b对WWOXTCF21BRCA1BRCA2的表达影响较小,并不占主要调控位置,其他甲基转移酶是这些基因发生甲基化的主要因素,目前研究者对乳腺癌易感基因的甲基化研究还不够成熟,往往出现矛盾的结果,具体原因还有待进一步探讨。

综上所述,Dnmt3b可影响乳腺癌细胞相关基因WWOXTCF21BRCA1BRCA2MMP7TIMP1PKM2survivin及miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-200b、miR-203b、miR-409、miR-127、miR-520a的表达。DNA甲基化是一种可逆的表观遗传学修饰方式,逆转与肿瘤发生发展相关的miRNA基因甲基化水平将改变肿瘤细胞的生物学特性,为肿瘤的精准治疗提供新的方向[25]。本实验从Dnmt3b对miRNA及mRNA的影响作用出发,应用siRNA干扰的方法改变Dnmt3b的表达,检测乳腺癌相关miRNA及mRNA的表达情况,明确了Dnmt3b对miRNA及靶基因mRNA的相互调控机制,为乳腺癌的临床精确诊治提供了依据。

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