增食欲素是下丘脑的神经肽，包括增食欲素A（orexin-A）和增食欲素B（orexin-B）2种，在调节睡眠、觉醒、神经内分泌平衡、摄食、应激反应等行为中起十分重要的作用^[1-4]。增食欲素有2种膜结合G蛋白耦联受体，即增食欲素受体1（orexin receptor-1，OX₁R）和增食欲素受体2（orexin receptor-2，OX₂R）。orexin-A是OX₁R的高亲和力受体激动剂，相比之下，orexin-A对OX₂R亲和力较低^[5-7]。研究^[8]表明，orexin-A比orexin-B的生物学作用更广泛且重要。既往研究与本课题组前期研究^[9-11]均发现增食欲素对多种内分泌腺细胞增殖、凋亡、细胞活力有影响，但对自噬的作用鲜有研究。因此，本研究拟分析orexin-A对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞自噬的作用，即对LC3Ⅰ、LC3Ⅱ以及Beclin-1蛋白表达水平的影响，以及orexin-A调节PC12细胞自噬后对去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）分泌水平的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

DMEM培养基和10%胎牛血清购自德国默克Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，ELISA试剂盒购自武汉云克隆公司；戊二醛固定液购自北京百奥莱博科技有限公司；兔抗LC3多克隆抗体购自中国ABclonal公司；兔抗Beclin-1抗体购自英国Abcam公司；OX₁R抑制剂SB334867购自美国Cell signalling公司；自噬抑制剂3-MA试剂盒购自美国Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒、Western blotting一抗和二抗稀释液均购于自碧云天生物技术研究所；GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗等均购自艾博抗（上海）贸易有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

低温高速离心机（3K-15）购自德国Sigma公司；化学发光仪（4200SF）购自中国天能仪器公司；酶标仪购自奥地利安托斯仪器公司；低速离心机购自科大创新股份有限公司中佳分公司；电热恒温干燥箱购自北京市光明医疗仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组

将PC12细胞接种在DMEM高糖培养基+10%胎牛血清+1%双抗（100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素）培养基中，于37 ℃、100%湿度、5%CO₂的恒温培养箱中培养，每1~2 d换液1次。待细胞处于对数生长期时，取出培养皿，将细胞接种于24孔板中（2 mL/孔）。既往研究^[12]发现，10^-6 mol/L orexin-A刺激肾上腺髓质分泌肾上腺素及NE显著，因此，本研究采用10^-6 mol/L orexin-A进行实验。细胞培养24 h后，分为3组进行实验，即orexin-A组（加入10^-6 mol/L orexin-A），orexin-A+OX₁Ri组（SB334867预处理1 h后加入10^-6 mol/L orexin-A）和空白对照组，每组设3个复孔，每组处理时间为24 h。

1.2.2 透射电镜观察

弃掉空白对照组和orexin-A组培养基，用PBS洗涤3次后，将PC12细胞移入新的离心管中，3 000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL 2.5%戊二醛固定24 h，透射电镜下观察并拍照。

1.2.3 Western blotting

收集各组处于对数生长期的PC12细胞，加入裂解液冰上充分裂解，BCA法测定蛋白浓度。调整蛋白浓度后，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，洗膜3次后转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h。加入一抗，4 ℃孵育过夜。洗膜3次后加入二抗，室温孵育2 h，洗膜3次，ECL显色。应用Image J软件分析结果。

1.2.4 ELISA检测上清液中NE含量

将细胞培养液从培养瓶移入离心管中，离心后弃沉淀，取上清液。按照ELISA试剂盒说明书检测上清液中NE含量。每个样品测定3次，用酶标仪检测OD值，计算每个样品的平均OD值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 Orexin-A上调PC12细胞OX₁R蛋白表达

如图 1所示，orexin-A显著上调了PC12细胞中OX₁R蛋白的表达水平（P < 0.05），而同时加入orexin-A和OX₁R抑制剂的PC12细胞中OX₁R蛋白的表达水平明显下降，且与空白对照组比较无统计学差异（P > 0.05）。

2.2 orexin-A对PC12细胞自噬的影响

如图 2所示，透射电镜下可见，空白对照组正常PC12细胞的细胞质结构致密，各细胞器清晰，形态良好，少见自噬的发生。而orexin-A组PC12细胞则较空白对照组自噬体增多。表明orexin-A促进了PC12细胞自噬。

2.3 orexin-A通过OX₁R促进PC12细胞自噬

如图 3、4所示，orexin-A组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表达水平均显著高于空白对照组，而orexin-A+OX₁Ri组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表达水平则显著低于orexin-A组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。orexin-A组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著高于空白对照组和orexin-A+OX₁Ri组。

2.4 orexin-A对PC12中NE分泌的调节

结果显示，orexin-A组NE浓度[（1.99±0.14）pg/mL]显著高于空白对照组[（1.77±0.10）pg/mL]，差异有统计学意义（P < 0.05）；而orexin-A+OX₁Ri组的NE浓度[（1.88±0.13）pg/mL]显著低于orexin-A组，差异有统计学意义（P < 0.05）。提示orexin-A可能是通过OX₁R上调PC12细胞NE分泌水平。

3 讨论

orexin-A和orexin-B是来自同一前体前orexin原的神经肽。二者高度表达于涉及摄食行为的侧下丘脑区域，也存在于肾上腺、胃肠道、胰腺等外周组织及血液中。增食欲素的2个功能性受体（OX₁R、OX₂R）广泛且有差异地分布于脑组织中，也见于肾脏、肾上腺、甲状腺、睾丸、卵巢、空肠、肺等外周组织中。研究^{[5-6, 13-14]}表明，orexin-A与OX₁R的结合力是orexin-B与OX₁R结合力的5~100倍，而orexin-A和orexin-B对于OX₂R则具有相似的亲和力。相对于orexin-B，orexin-A稳定性好、生物学作用更强且广泛，而orexin-A又是OX₁R的高亲和力受体激动剂，因此，本研究主要探讨orexin-A与OX₁R的作用。结果显示，orexin-A组PC12细胞中OX₁R的蛋白表达水平显著高于空白对照组，而加入受体抑制剂后，PC12细胞OX₁R的蛋白表达水平显著下降（P < 0.05），提示orexin-A上调了PC12细胞OX₁R蛋白的表达。

增食欲素系统具有调节摄食与能量平衡，促进觉醒，以及调节呼吸、情绪、心率、血压等作用^[15]。近年来的研究主要关注于增食欲素对细胞增殖、凋亡、活力、激素分泌的作用，但对细胞自噬的影响鲜有研究。细胞自噬被称为Ⅱ型程序性细胞死亡，是依赖溶酶体降解细胞质内细胞器和大分子物质的代谢途径^[16]。自噬在细胞新陈代谢、结构重建、生长发育中起着重要作用。本研究发现，透射电镜下可见orexin-A组PC12细胞的自噬体较空白对照组PC12细胞增多，提示orexin-A可能促进了细胞自噬。LC3是自噬标志物，有LC3Ⅰ和LC3Ⅱ 2种表现形式，自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3Ⅰ）会酶解掉一小段多肽，转变为活化形式的LC3（自噬体膜型），即LC3Ⅱ。研究^[17-18]表明，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与自噬体形成的数量成正比，因此，可用LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值估计自噬水平，比值增高往往代表自噬体形成。Beclin-1是酵母ATG6的同源体，也是自噬相关的特异性基因，调控自噬前体和自噬体的形成^[19]。因此，也可用其表达水平判断自噬水平，Beclin-1升高是自噬形成的重要指标^[20]。本研究结果显示，orexin-A组PC12细胞的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1的蛋白表达水平均显著高于空白对照组和orexin-A+OX₁Ri组（P < 0.05）。提示orexin-A可能通过OX₁R来激活自噬相关蛋白LC3和Beclin-1，从而促进PC12细胞自噬，但其具体机制有待进一步研究。

本研究还发现，orexin-A组PC12细胞的NE含量显著高于空白对照组，而加入OX₁Ri组PC12细胞的NE含量明显下降，说明orexin-A通过OX₁R影响细胞自噬、调节PC12细胞的NE分泌水平，提示PC12细胞的NE分泌调节机制可能与细胞自噬有关。

综上所述，本研究发现orexin-A可能通过OX₁R促进PC12细胞自噬，并上调PC12细胞的NE分泌水平，且orexin-A对PC12细胞NE分泌水平的调节机制可能与细胞自噬有关。尽管具体的分子机制还需进一步探索，但本研究发现了orexin-A对肾上腺细胞自噬的促进作用，补充了orexin-A的生物学功能，对于进一步认识orexin-A具有重要意义。orexin-A及其受体OX₁R可能成为调节肾上腺功能紊乱的治疗靶点之一。