神经管畸形（neural tube defects，NTDs）是胚胎发育过程中神经板无法闭合形成神经管而造成的，全世界约有3%新生儿患有这种缺陷，是导致围产期婴儿死亡的原因之一^[1]。NTDs通常分为开放性缺损（颅脊柱裂、无脑畸形和脊髓脊膜膨出）和闭合性缺损（脑膨出、脑膜膨出和隐性脊柱裂）^[2]。

细胞迁移是神经管闭合过程中重要的生物学功能之一。随着细胞的迁移会失去其极性和细胞间黏附性，细胞间黏附分子发生改变，使上皮细胞转变成具有侵袭性的间充质细胞，这一过程被称为上皮细胞间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）^[3]。Ⅰ型胶原蛋白α1（collagen type Ⅰα 1，COLIA1）是胶原蛋白家族的成员，广泛分布于骨骼、软骨、皮肤、心脏瓣膜、肺以及结缔组织中^[4]。研究^[5]显示，COLIA1突变可能会导致胚胎发育过程中的成骨不全。此外，SUN等^[6]研究表明，COLIA1可能通过NF-κB信号通路调节恶性星形细胞瘤细胞的侵袭能力，促进肿瘤细胞的迁移。目前，COLIA1与NTDs的关系研究尚未见报道。本研究探讨全反式维甲酸（all-transretinoic acid，ATRA）诱导的小鼠NTDs模型中COLIA1表达对神经细胞迁移活动的影响，旨在为阐明NTDs的发生机制提供新的理论依据。

1 材料与方法 1.1 NTDs模型制备及组织样本收集

8~10周龄C57B1/6J雌性小鼠（北京华阜康生物技术有限公司）30只，饲养于中国医科大学附属盛京医院SPF级实验动物房。于前1 d晚合笼，第2天观察雌性小鼠有无阴道栓存在，有阴道栓雌性小鼠单独放一笼，标记为孕0 d（E0）。在E8.5将已孕小鼠随机分为NTDs组[将ATRA（70 mg/kg）溶于橄榄油后，给予一次灌胃处理，n = 15）、对照组（给予同体积的橄榄油灌胃，n = 15）。于E9.5处死，剖宫取出胎鼠。

1.2 细胞培养和转染

小鼠神经干细胞C17.2培养于含10%胎牛血清（美国Gibco公司）、1%MEM NEAA（美国Gibco公司）、1%双抗（100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素）的EMEM（美国Gibco公司）中，于37 ℃，5%CO₂的细胞培养箱中培养。培养24 h后转染sh-negative control（sh-NC）、sh-COLIA1 1#、sh-COLIA1 2#、sh-COLIA1 3#（中国吉玛公司）至C17.2细胞。

1.3 Western blotting检测

从胚胎和转染后48 h的C17.2细胞中用RIPA提取蛋白质。通过8%的SDS-PAGE电泳分离样品蛋白，然后电转印至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2 h。一抗COLIA1（1∶1 000，美国Cell Signal Technology公司）、E-cadherin（1∶1 000，美国BD公司），Snail（1∶1 000，中国万类公司）、Vimentin（1∶1 000，中国Proteintech公司）、β-actin（1∶1 000，中国Proteintech公司）4 ℃下过夜。第2天用TBST室温洗膜3次，每次10 min，然后在室温下与HRP兔和鼠二抗（1∶5 000，中国Proteintech公司）孵育2 h，ECL试剂发光。

1.4 细胞划痕实验

在6孔板中加入约5×10⁵细胞，第2天用枪头进行划痕，PBS洗涤细胞3次去除划下的细胞，加入无血清培养基，在5% CO₂的细胞培养箱中培养48 h后拍照。

1.5 细胞Transwell迁移实验

转染细胞撤血清饥饿12~24 h后消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，PBS洗1~2次后无血清培养基重悬，调整细胞密度为5×10⁵/mL。取细胞悬液100 μL加入8孔Transwell小室的上室，下室加入600 μL含血清的培养基，培养细胞12~48 h。取出Transwell小室，弃去孔中培养液，甲醇固定30 min，将小室适当风干。0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，PBS洗3次。显微镜（×200）下随机5个视野计数细胞。

1.6 统计学分析

利用SPSS 26.0软件进行统计分析，GraphPad8.0统计软件作图，计量资料以x±s表示；组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 COLIA1在ATRA致畸小鼠模型中的表达

Western blotting检测E9.5小鼠胚胎组织COLIA1的表达结果显示，对照组、NTDs组COLIA1表达分别为1.132±0.118，0.875±0.106。与对照组比较，NTDs组COLIA1表达显著降低（P < 0.05），COLIA1的表达对NTDs的形成可能起到抑制作用。见图 1。

2.2 对照组和NTDs组E-cadherin、Vimentin和Snail表达比较

结果显示，与对照组比较，NTDs组Vimentin和Snail表达降低，而E-cadherin表达上升（均P < 0.05）。说明在NTDs胚胎中细胞迁移能力降低，EMT进程减慢，推测COLIA1可能抑制神经管闭合中迁移活动以及EMT的发生。见图 2、表 1。

2.3 COLIA1对神经细胞迁移活动的影响

为了探究COL1A对神经细胞迁活动的影响，分别在C17.2细胞中转染sh-NC、sh-COLIA1 1#、sh-COLIA1 2#、sh-COLIA1 3#载体48 h后进行Western blotting检测，结果显示沉默COLIA1时，沉默2链效果更明显，因此后续实验应用sh-COLIA1 2#载体。结果显示，与对照组比较，sh-COLIA1 2#组E-cadherin表达明显上升（P < 0.05），而Snail、Vimentin表达明显下降（P < 0.05），提示COLIA1能够促进EMT的发生，见表 2、图 3。此外，细胞划痕以及Transwell迁移实验结果显示沉默COLIA1可明显抑制神经细胞的迁移（图 4）。

3 讨论

神经嵴干细胞具有强大迁移能力和多项分化潜能，是具有迁徙功能的过渡性多能细胞群体^[7]。随着神经褶皱开始闭合形成神经管，于神经外胚层和非神经外胚层边界的神经嵴脱层，沿着整个前后体轴广泛迁移，分化形成其他不同结构^[7]。在神经板闭合为神经管的过程中，EMT进程参与神经细胞的迁移、游走和定植的调控。在EMT进程中，具有上皮特性E-cadherin随着EMT的发生表达逐渐降低^[8]。E-cadherin主要定位于胚胎表皮外胚层细胞和神经板边界，随着细胞的迁移，神经板内陷，中央神经板逐渐与外胚层分离，E-cadherin逐渐失去。因此，E-cadherin表达增高，细胞迁移失败，导致神经管闭合失败^[9]。Snail作为EMT转录抑制因子可与编码E-cadherin基因的启动子中保守的E-box序列相结合，使E-cadherin的表达下调，并且研究^[10]证实，Snail高表达可促进了神经嵴细胞的迁移，并参与神经管的分层。此外，研究显示在NTDs胎儿中Vimentin表达下调^[11]。由此可见，神经细胞的迁移活动对神经管的闭合有重要作用，并且EMT标志物会伴随神经管闭合过程变化，与本研究结果一致。已有研究^[12-13]报道转录因子Pax3对于明确神经板边界和促进神经嵴细胞的形成至关重要，并且调控EMT的关键转录因子Snail可作为Pax3的直接靶点。本研究发现，在神经管闭合过程中COLIA1能够引起EMT标志物E-cadherin、Snail和Vimentin表达的变化，进而调控细胞迁移，但这些EMT标志物是否为COLIA1的直接靶点以及具体的调控机制还有待进一步研究论证。

COLIA1可作为成骨标志物参与成骨的形成，还可作为哺乳动物最丰富的细胞外间质（extracellular matrix，ECM）之一^[14]。而ECM周期性重塑对细胞的迁移活动同样至关重要。已有大量研究证实COLIA1调控细胞迁移活动。COLIA1可促进胃癌细胞的迁移和侵袭，COLIA1过表达诱导TGF-β信号通路激活，进而促进EMT进程^[15]。本研究在NTDs模型中发现COLIA1表达降低且伴随EMT相关指标异常。另外，当沉默C17.2细胞的COLIA1表达后，细胞的迁移活动降低，促进EMT进程标志物表达下降。由此表明，COLIA1表达降低可能抑制了神经管发育过程中神经细胞的迁移活动。

综上所述，COLIA1能够促进细胞的迁移活动以及EMT进程，进而减少NTDs的发生。COLIA1有望成为治疗NTDs的新靶点，然而关于COLIA1如何具体调控EMT进程中的关键分子以及EMT上游分子（PAX3等）与COLIA1之间的关系尚不明确，有待于进一步研究论证。