短串联重复序列（short tandem repeats，STR）具有高灵敏度、高鉴别能力、高种属特异性和易于标准化分型等优点，目前被广泛应用，但其在检测降解检材方面表现出明显不足。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）被认为是第三代遗传标记^[1-2]，大约平均每1 000 bp存在1个SNP，在人类基因组中约有300万个SNP，其数量要比STR超出几个数量级；多表现为二等位基因标记，易于分型和确定基因频率；SNP的片段短，适合PCR扩增，分析降解DNA能力更强；遗传标记突变率低，具有较高的稳定性；分析方法较多，易于进行自动化分型；编码区SNP与表型有关，研究价值大。但是，由于SNP的二等位基因性质，多态信息含量（polymorphism information content，PIC）远低于STR，多个SNP的集合应用方能达到与STR相当的识别率。因此，发现多态性程度较高的SNP具有重要的法医学意义。

磺基转移酶（sulfotransferase，SULTs）家族参与代谢大量小型内源性和外源性化学物质，包括药物、毒性化合物、类固醇激素和神经递质^[3]。SULT4A1基因位于22号染色体长臂（22q13.2-q13.31）^[4]，序列高度保守。其编码的磺基转移酶与其他磺基转移酶同源性低，但在物种间高度保守^[5]，在脑内高度表达^[6]。

SULT4A1基因有多个多态性位点被报告（https://www.ncbi.nlm.nih.gov），但是尚缺乏中国汉族相关的遗传分布数据。本研究拟调查SULT4A1基因rs549267654、rs2285162、rs963263和ss2137544034位点在中国北方汉族群体的多态性分布，并探讨其法医学的应用价值。

1 材料与方法 1.1 材料

226例中国北方汉族无血缘关系健康个体血液样品由中国医科大学法医学院提供，样品提供者均签署知情同意书，伦理批件号为[2016]063。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及定量

酚/氯仿法提取全血基因组DNA，紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度。

1.2.2 PCR扩增

设计3对特异性引物（表 1），用于扩增SULT4A1基因5’端（-804 bp~+167 bp）及含有rs2285162和rs963263位点的DNA片段。

扩增体系20 μL，内含5 U/μLrTaq酶（日本TaKaRa公司）0.2 μL，10×Buffer 2 μL，dNTP 2 μL，5 pmol/μL上下游引物各1.5 μL，20 ng/μL DNA模板2 μL，灭菌去离子水10.8 μL。反应条件为95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循环30次。

SULT4A1基因5’端及rs963263位点的PCR扩增体系Buffer为2×GC Buffer Ⅱ，反应条件中的延伸时间为72 ℃ 40 s和72 ℃ 20 s，其他条件相同。

1.2.3 扩增产物检测

SULT4A1 5’端PCR扩增产物委托沈阳莱博睿生物科技开发有限公司进行测序分析，测序引物正向引物5’-TTTACCAATGTAAGCTCCAACAGGG-3’；反向引物5’-GACTTGGGGTAGGTGACGATC-3’。测序结果利用Chromas2.23和DNAman8.0软件进行分析。rs2285162和rs963263位点以限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）方法进行分型。反应体系为10 μL，1 U/ μL酶1 μL，Buffer 1 μL，PCR产物1 μL，灭菌去离子水7 μL，水浴1 h。酶切产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳时间分别为30 min和50 min，EB显色后进行分型。rs2285162位点使用BstYⅠ酶，NEB Buffer2.1，60 ℃水浴；rs963263位点使用HhaⅠ酶，CutSmart Buffer，37 ℃水浴。

1.3 统计学分析

根据测序以及RFLP分型结果计算基因型频率和等位基因频率，并通过Haploview4.2软件进行Hardy-Weinberg平衡检验并进行连锁不平衡分析。计算杂合度、个人识别力、非父排除率和PIC。用SPSS 22.0软件检验不同人群间等位基因分布差异。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 4个位点的基因型分型

根据RFLP图谱可以对rs2285162和rs963263位点进行正确分型（图 1、2）。根据DNA序列分析图谱在SULT41基因5’端DNA片段中可对rs549267654进行分型，同时在-77~-72处发现了新的6 bp（TGCGGG）插入位点，已经上传至美国国家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI），命名为ss2137544034（图 3）。

2.2 4个位点的遗传多态性分布

rs549267654、rs2285162、rs963263和ss2137544034位点在中国北方汉族群体中均具有遗传多态性。位点ss2137544034只检测到2种纯合型，并未检测到杂合型。4个位点的等位基因见表 2。因新发现位点ss2137544034不符合Hardy-Weinberg，所以不进行后续的分析。

2.3 3个位点的法医学参数

根据SULT4A1基因3个位点在中国北方汉族群体中的遗传多态性，计算各位点的法医学参数（表 3）。其中rs549267654、rs2285162和rs963263位点的个人识别率均超过0.6，非父排除率均接近0.2。

2.4 单倍型及连锁关系分析

3个位点的连锁分析结果显示，rs549267654、rs2285162和rs963263位点可以组成8种单倍型，其中4种单倍型的频率 > 5%（表 4）。组成单倍型后的个人识别率为0.843。

3 讨论

SNP可以弥补STR在严重降解检材检验中不能提供遗传信息的不足，但SNP作为遗传标记应用于法医学实践必须具有不同民族或地域的群体遗传学数据。本研究检测了中国北方汉族个体SULT4A1基因rs549267654、rs2285162、rs963263和ss2137544034等4个位点，并提供了其多态性分布数据与相关的法医学参数。结果表明，rs549267654、rs2285162和rs963263位点具有较好的遗传多态性，个人识别几率为0.619~0.649，非父排除率为0.177~0.187。其组成的单倍型的个人识别率为0.843。说明上述3个位点是较好的法医学个人识别与亲权鉴定备选的遗传标记。

ss2137544034位点是本研究通过序列分析在SULT4A1基因5’端的-77 bp~-72 bp处新发现的，其形态为6个核苷酸（TGCGGG）的插入/缺失。本研究的样品中，只检测到了插入或缺失的纯合型，未发现其杂合型，其个人识别率及非父排除率分别为0.434与0.17，具有较好的应用意义。其多态性分布不符合Hardy-Weinberg平衡（P < 0.05），经结果核验后不排除是位点突变所致。

本研究检测的遗传标记在国内还没有相关报道，将由NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）检索到的SULT4A1基因rs549267654，rs2285162和rs963263位点在欧洲白人、非洲黑人、美国白人群体的多态性数据与本研究数据进行比较。中国北方汉族群体的等位基因频率分布与黑人（非洲）和白人（美国、欧洲）人群的差异有统计学意义，rs2285162与rs963263位点等位基因的频率之比在黑人（非洲）中均约为0.9:0.1，多态性程度较低，属于低识别能力类遗传标记。在人类遗传学研究领域可能更有意义。

SULT4A1基因在人体内高度保守^[7]，其野生型蛋白仅在脑部神经元中表达，随着小鼠神经系统的成熟野生型蛋白表达增多^[8]，说明SULT4A1对神经系统发育有着重要作用。有研究^[9]表明，在美国白种人群，SULT4A1基因5’UTR的多态性与精神分裂症存在显著的关联性。深入探讨SULT4A1基因的多态性位点与精神分裂症之间的关联，可能在法医司法精神病鉴定的研究工作中具有一定意义。