中国医科大学学报  2020, Vol. 49 Issue (8): 743-746

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潘鑫, 李亚彩, 王晓黎
PAN Xin, LI Yacai, WANG Xiaoli
导致原发性Ⅰ型肾小管酸中毒的SLC4A1突变R388C致病机制的细胞学研究
Cytological study of the mechanism of SLC4A1 mutant R388C causing primary typeⅠtubular acidosis
中国医科大学学报, 2020, 49(8): 743-746
Journal of China Medical University, 2020, 49(8): 743-746

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收稿日期：2019-11-01
网络出版时间：2020-07-29 8:43
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引用本文
潘鑫, 李亚彩, 王晓黎. 导致原发性Ⅰ型肾小管酸中毒的SLC4A1突变R388C致病机制的细胞学研究[J]. 中国医科大学学报, 2020, 49(8): 743-746.
PAN Xin, LI Yacai, WANG Xiaoli. Cytological study of the mechanism of SLC4A1 mutant R388C causing primary typeⅠtubular acidosis[J]. Journal of China Medical University, 2020, 49(8): 743-746.
导致原发性Ⅰ型肾小管酸中毒的SLC4A1突变R388C致病机制的细胞学研究
潘鑫 , 李亚彩 , 王晓黎     
中国医科大学附属第一医院内分泌科, 内分泌研究所, 辽宁省内分泌疾病重点实验室, 沈阳 110001
收稿日期：2019-11-01；网络出版时间：2020-07-29 8:43
基金项目：辽宁省教育厅重点实验室基础研究项目（LS201615）
作者简介：潘鑫(1994-), 女, 硕士研究生.
通信作者：王晓黎，E-mail：wlittlepear@163.com.
摘要：目的 对导致原发性Ⅰ型肾小管酸中毒的SLC4A1基因突变R388C致病机制进行细胞学研究。方法 构建SLC4A1基因的野生型和突变型表达质粒，通过在HEK-293细胞中表达质粒，分析突变蛋白的致病机制。结果 成功构建了SLC4A1基因的野生型和突变型表达质粒，转染至HEK-293细胞中发现，突变型蛋白无法转运到细胞表面，从而影响了其发挥正常的功能。结论 SLC4A1基因的R388C突变系通过影响蛋白的正常传输而导致原发性Ⅰ型肾小管酸中毒。
关键词：Ⅰ型肾小管酸中毒    遗传性远端肾小管酸中毒    SLC4A1基因    低钾血症    
Cytological study of the mechanism of SLC4A1 mutant R388C causing primary typeⅠtubular acidosis
PAN Xin , LI Yacai , WANG Xiaoli     
Department of Endocrinology and Metabolism, Institute of Endocrinology, Liaoning Provincial Key Laboratory of Endocrine Diseases, The First Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China
Abstract: Objective To explore the mechanism of SLC4A1 gene mutation R388C that lead to primary typeⅠtubular acidosis by cell experiments. Methods Wild-type and mutant expression plasmids of SLC4A1 gene were constructed, and the mechanism of the mutant protein was analyzed by expressing plasmids in HEK-293 cells. Results The wild-type and mutant expression plasmids of SLC4A1 gene were successfully constructed and transfected into HEK-293 cells. The mutant protein could not be transported to the cell surface, which affected its normal function. Conclusion The R388C mutant of SLC4A1 gene leads to primary typeⅠtubular acidosis by affecting the normal transport of the protein.
Keywords: typeⅠtubular acidosis    hereditary distal renal tubular acidosis    SLC4A1 gene    hypokalemia    

Ⅰ型肾小管酸中毒又被称为远端肾小管酸中毒(distal renal tubular acidosis，dRTA），在成人中常继发于其他疾病，如慢性肝脏疾病、自身免疫性疾病、肾移植、药物性肾损伤等。原发性dRTA多见于儿童，致病基因主要为编码位于顶膜H+-ATP酶B1和A4亚单位的ATP6V1B1(MIM：192132)基因和ATP6V0A4(MIM：605239)基因，以及编码基底膜阴离子(Cl-/HCO3-)转运体1(anion exchanger 1，AE1)的SLC4A1(MIM：109270)基因[1-2]，其他基因还包括FOXI1(MIM：601093)基因[3]和WDR72(MIM：613214)基因[4]，但较为少见，除此之外还有15%左右的基因位点不明[2, 5]。典型dRTA的临床表现为慢性代谢性酸中毒、低钾血症、高尿钙、肾脏钙质沉着和肾结石，尿液偏碱性。但原发性dRTA的临床表现异质性较强，部分不典型dRTA患者有可能至成年后才得到确诊，容易延误诊治[6-7]。本文对我院诊断为dRTA的1例成人患者及其父亲携带的一处新型SLC4A1基因杂合性突变R388C进行了细胞学研究，证实了该突变是导致dRTA的致病原因，并总结了目前已知的可导致dRTA的SLC4A1基因突变的类型和特点。

1 材料与方法 1.1 研究对象

研究对象为2018年在我院因低钾血症就诊、经基因诊断为原发性dRTA的1例患者及其父亲，2人均接受了病史采集、甲状腺功能、肾功能、尿常规、甲状腺和肾上腺相关激素以及影像学检查等，明确低钾血症的病因，并进行了二代基因测序。本研究已通过我院伦理委员会审核批准，所有研究对象均签署了知情同意书。

1.2 检测方法

采用全自动生化仪检测肝肾功能、血离子，采用免疫化学发光法测定促肾上腺皮质激素、皮质醇等。采用放射免疫法测定肾素、血管紧张素、醛固酮、胰岛素等。

提取患者及其父亲基因组DNA，利用经过生物素标记的探针(P039-Exome，北京迈基诺公司)与文库DNA杂交，进行外显子捕获，在NextSeq 500(美国Illumina公司)上进行高通量测序，测序数据经Burrows-Wheeler Aligner(v.0.7.10-r1039)软件将其比对到人类基因组并分析(基因组版本为GRCh37/hg19）。重点筛查与低钾血症临床表型相关的基因，并对检出的基因突变位点在患者及其父亲中采用一代测序验证。

1.3 细胞学实验

使用GV230(CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin，吉凯基因)质粒，利用XhoⅠ/KpnⅠ酶切位点导入野生型SLC4A1基因序列(NM_000342)和其突变型(R388C)基因序列，测序验证后，抽提质粒并保存。培养HEK-293细胞至80%融合度后，利用Lipofectamine 2000试剂盒(美国Invitrogen公司)转染上述质粒至细胞。培养48 h后利用荧光显微镜(德国徕卡公司)观察细胞形态。

2 结果 2.1 临床资料

患者，男，30岁，既往有发作性软瘫7年的病史，常因为天气变凉而诱发，实验室检查发现间断低钾血症(入院后血钾3.33 mmol/L），长期自行补钾治疗。家族史：父亲有类似表现，但未经系统诊治。患者无肾损伤相关用药史和其他肝脏疾病、自身免疫性疾病病史，完善了其他低钾血症病因的相关检查，如肾上腺增强3D-CT未见异常，促肾上腺皮质激素-皮质醇节律和测定值在正常范围，肾素-血管紧张素-醛固酮水平正常，风湿抗体系列正常。因临床表现不典型，且存在家族史，故行二代测序明确低钾原因。

2.2 基因检测结果

全外显子组测序提示，患者携带一处位于SLC4A1基因(NM_000342)第11外显子上的杂合性突变(c.1162C > T，p.Arg388Cys）。Sanger测序验证了本突变，并且对患者亲属的相应位点进行了测序，发现患者父亲携带相同突变(图 1A、1B）。

A, pedigree of the kindred showing proband and his father carrying the same mutation and clinical phenotype; B, sequencing electrophoretogram of SLC4A1 gene, suggesting that arginine(Arg)at position 388 is substituted by cysteine(Cys); C, schematic diagram of SLC4A1 gene with reported mutations:upper parts, autosomal recessive(AR)mutations and lower parts, autosomal dominant(AD)mutations. 图 1 患者的家系图和基因测序结果和SLC4A1基因突变示意图 Fig.1 Pedigree of the kindred and sequencing result of SLC4A1 gene with schematic diagram of the mutation sites
图选项

2.3 细胞学实验

将携带野生型和突变型SLC4A1基因序列的GV230质粒转染到HEK-293细胞后，培养48 h后在荧光显微镜下观察发现，转染野生型SLC4A1质粒的细胞可见SLC4A1绿色荧光蛋白分布于细胞表面，提示蛋白合成后可转运至正常位置；而转染突变型SLC4A1质粒的细胞可见SLC4A1绿色荧光蛋白分布在细胞质内，无法达到细胞表面，不能发挥正常作用(图 2）。

A, transfection of wild-type kAE1 plasmid, wild-type kAE1 plasmid can be expressed on the cell surface; B, transfection of mutant kAE1 plasmid, mutant kAE1 plasmid is diffusely distributed inside the cell and cannot be transported to the cell surface. 图 2 转染野生型kAE1和野生型kAE1质粒的HEK293细胞  ×200 Fig.2 HEK293 cells transfected with wild-type kAE1 and wild-type kAE1 plasmid  ×200
图选项

3 讨论

dRTA分为原发性和继发性，继发性因素包括慢性肝脏疾病、自身免疫性疾病、肾移植、药物性肾损伤等，多见于成人。而原发性dRTA多为婴幼儿起病，甚至不能成活，成人起病较为少见，多为不完全性或非经典性，因此较难鉴别，需细致除外继发性因素。典型dRTA的临床表现包括软瘫或抽搐等低钾血症表现、骨骼异常表现(成人骨软化症、儿童佝偻病、骨折、骨痛等）、感觉神经性耳聋等，实验室检查会发现阴离子间隙正常的代谢性酸中毒、低钾血症、高尿钙、尿液pH值增高，必要时可完善氯化铵试验，判断肾小管的酸化功能。影像学检查会发现肾脏钙质沉着(常见)和肾结石(少见），骨骼呈佝偻病样改变，在部分听力减低的患者中，内耳CT检查可发现前庭导水管扩张[5]。本文的患者以低钾血症就诊，起病年龄较早，并且与其父亲有相似的临床表现，因此考虑遗传性疾病的可能性。由于患者症状不典型，并无其他dRTA临床表现，因此并未首先考虑遗传性dRTA，而是直接进行了二代测序以明确低钾血症的病因，这体现了二代测序在诊断不典型遗传性疾病中的优势。

以往认为遗传性dRTA的致病基因主要为ATP6V1B1基因、ATP6V0A4基因和SLC4A1基因，其中最多见的为ATP6V1B1基因和ATP6V0A4基因(共占70%），SLC4A1基因突变约占15%左右[2, 5]，新近有个例报道FOXI1基因[3]和WDR72基因突变也可以导致遗传性dRTA[4]，此外还有15%的患者家系存在未知的基因突变位点。由于遗传性dRTA的致病基因较多，因此在临床中可疑遗传性dRTA的患者同样应推荐进行性价比较高的二代测序进行基因诊断。

通常ATP6V1B1、ATP6V0A4、FOXI1和WDR72基因突变导致的dRTA的临床表现(代谢性酸中毒和低钾血症)要比SLC4A1基因突变导致的dRTA严重(前3个基因突变的临床表现常伴随耳聋)[3-4, 8]。SLC4A1基因编码的蛋白可在肾脏和红细胞膜中表达，在红细胞膜中表达的AE1又称为带3蛋白，是红细胞膜的重要组成成分，因此部分突变类型可造成遗传性球形红细胞血症，从而导致溶血性贫血。在肾脏的α闰细胞中表达的AE1又称为kAE1，可使碳酸氢根与氯离子交换并重吸收入血液。因此，其功能受损会导致酸中毒、低血钾、尿钙增加等一系列dRTA的临床表现。

目前文献已报道导致dRTA的SLC4A1基因突变有36处，遗传模式根据突变类型不同可表现为常染色体显性遗传(autosomal dominant，AD)或常染色体隐性遗传(autosomal recessive，AR)[9-10]，热点区域为第11、13、15和20外显子。AD dRTA的发生机制为kAE1二聚体中的杂合性突变蛋白导致正常kAE1蛋白的运输障碍，又称之为“显性-隐形效应”，如R589H和S613F [11]，以及集中于C端第20外显子的突变，如A888L/D889X(del20bp)[7]、R901X(ins13bp)[12]、D902N[13]、D905dupCGA(ins3bp)[14]、D905G fs15(ins1bp)[15]、E906Q[16]和M909T[17]。而导致AR dRTA最常见的位点是位于第17外显子的G701D [14, 18]。本例患者的SLC4A1基因突变R388C位于第11外显子，系kAE1蛋白N端的双性螺旋1区域(H1区域），属于高度保守区域，推测R388C可能会引起kAE1构像上的变化，造成其与野生型kAE1形成的杂合二聚体停留在内质网内，无法正常转运至胞膜发挥正常的作用，这也在本研究的细胞实验中得到了证实，在遗传模式和致病机制方面都符合AD模式的dRTA。SLC4A1基因突变导致的dRTA临床表现异质性较强，甚至相同突变的表现也不尽一致，通常AD模式的临床表现要轻于AR模式[1]。本例患者及其父亲起病时间长，就诊时无酸中毒表现，仅表现为间断低钾血症、碱性尿和高尿钙，父亲甚至常年未正式就医，这与其他AD模式的dRTA临床表现相似[6-7, 13]。

dRTA的治疗首要是要及时纠正酸中毒和低钾血症，从而避免出现急性症状和降低慢性并发症的严重程度(如生长迟缓、肾钙质沉着、骨软化、肾小球滤过率下降等），通常选择碱性药物如枸橼酸钾、枸橼酸钠等；其次是要定期随访，监测血气分析、血离子、尿离子、肾脏超声、骨密度、听力等；三是建议做基因检测，可以选择二代测序，并合理的进行遗传咨询[1]。

综上所述，本文对文献中已报道的SLC4A1基因突变进行了归纳总结，并对前期发现的位于SLC4A1基因H1区域的一处突变R388C进行了发病机制的探讨，细胞学实验证实突变的kAE1蛋白无法达到细胞表面发挥正常的离子转运功能，提示本突变是造成AD dRTA的分子基础。

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