2020, Vol. 49文章信息
- 唐诗, 辛颖
- TANG Shi, XIN Ying
- 宫内发育迟缓大鼠胰腺骨保护素的表达及其对胰腺发育的影响
- Osteoprotegerin expression in the pancreas of intrauterine growth retardation rats and its effect on pancreatic development
- 中国医科大学学报, 2020, 49(8): 716-721, 726
- Journal of China Medical University, 2020, 49(8): 716-721, 726
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文章历史
- 收稿日期：2019-08-15
- 网络出版时间：2020-07-29 9:30
引用本文 |
宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation，IUGR)是指胎儿未能达到其遗传基因影响下应有的大小。IUGR可增加成年期发生胰岛素抵抗、2型糖尿病等代谢综合征的风险[1-3]，其机制尚不十分清楚。目前普遍被认可的机制是“节俭表型假说”[2]，该假说指出胎儿及新生儿早期营养不良会导致胰岛β细胞的发育异常及胰岛功能损伤，这种解剖结构和功能的变化可能导致胰岛素敏感性降低，进而成年后发生2型糖尿病。
骨保护素(osteoprotegerin，OPG)是肿瘤坏死因子受体家族的成员，1997年由SIMONET等[4]发现，因具有保护骨的作用而得名。近年的研究[5-8]发现，OPG在人类及大鼠胰岛中均有表达。RIECK等[5]通过芯片筛查发现OPG在怀孕、肥胖和β细胞损伤动物模型中的表达水平均升高，提示OPG与胰岛β细胞之间存在密切的关系。但OPG对胰岛β细胞的具体影响目前仍存在争议[6-8]。
IUGR与OPG相关性的研究鲜有报道，且均集中于血清中OPG水平与IUGR关系的研究[9-11]。临床研究[9-10]表明，出生后1~4 d，IUGR组和健康组母亲和婴儿血清中OPG水平无差异；而动物研究[11]发现，IUGR幼鼠的血清OPG水平显著低于正常幼鼠。目前，尚无针对IUGR个体生长发育过程中胰腺组织中OPG表达情况的研究。本研究拟检测新生至成年期IUGR大鼠胰腺组织中OPG蛋白及mRNA的表达水平，旨在探讨OPG对IUGR大鼠胰腺发育的影响。
1 材料与方法 1.1 建立IUGR大鼠动物模型将体质量(body weight，BW)250~300 g的健康雌性处女Wistar大鼠(辽宁长生生物技术有限公司)以雌雄比例4:1与Wistar雄性大鼠合笼。将已受孕的大鼠按照喂养饲料不同随机分成2组：孕期全程低蛋白饮食组(蛋白含量8%)和标准饲料饮食组(蛋白含量20%）。低蛋白饮食组母鼠喂养至分娩，得到出生BW低于相应孕周第10百分位数以下的子鼠，即IUGR鼠，作为IUGR组；标准饲料饮食组母鼠喂养至分娩，得到正常子鼠，作为正常对照组(CON组）。
选择生后第1天、第1周、第3周及第12周作为研究时间点。为了排除雌激素的影响，选择雄性大鼠为研究对象。每个时间点、每组大鼠均为10只。
1.2 HE染色观察胰岛形态取大鼠胰腺组织，固定并石蜡包埋，制3 μm厚切片。二甲苯及梯度乙醇脱蜡；苏木素染色5 min，自来水冲洗30 min返蓝；伊红复染1.5 min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。光镜下观察胰岛形态。
1.3 Ki-67与insulin免疫荧光双染检测胰岛β细胞增殖情况将石蜡切片依次放入二甲苯及梯度乙醇中脱蜡，Tris-EDTA修复液微波7 min煮沸修复，驴血清室温封闭40 min，加入抗Ki-67抗体(1:200，美国Abcam公司)及抗insulin抗体(1:50，中国武汉博士德生物工程有限公司），4 ℃孵育过夜；次日复温后，驴抗小鼠Alexa Fluor 488(1:400，美国Abcam公司)与驴抗兔Alexa Fluor 594(1:400，美国Abcam公司)室温孵育2.5 h，DAPI染核5 min，甘油封片后在免疫荧光共聚焦显微镜(FV1000S，日本Olympus公司)下观察并拍照。每组选取5只大鼠，计算各组Ki-67+细胞数/总细胞数。
1.4 Western blotting检测胰腺组织OPG蛋白表达水平用RIPA裂解液提取大鼠胰腺组织总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，调整蛋白浓度并变性。40 μg蛋白上样，10%SDS-PAGE电泳分离蛋白，恒压电泳湿转电转法将蛋白质转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉溶液室温封闭PVDF膜2 h，分别加入兔抗大鼠OPG抗体(1:1 000，美国Abcam公司)和兔抗大鼠GAPDH抗体(1:6 000，美国Proteintech公司），4 ℃孵育过夜，山羊抗兔二抗(1:5 000，美国Proteintech公司)室温孵育2 h，ECL显色，应用Image J软件进行蛋白灰度分析，以相对灰度值代表蛋白表达量。
1.5 实时PCR检测胰腺组织OPG mRNA表达水平提取总RNA，应用PCR反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)逆转录合成cDNA。采用PCR扩增试剂盒(日本TaKaRa公司)进行PCR扩增，反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。PCR引物序列如下：OPG，F 5’-AAGTGGCTGTGCTGTGCACTC-3’，R 5’-CGGTTTCTGGGTCATAATGCAA-3’；GAPDH，F 5’-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3’，R 5’- CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3’。GAPDH作为内参照基因，表达量用2-ΔΔCt计算。
1.6 ELISA法检测血清胰岛素水平按照胰岛素ELISA试剂盒(武汉华美生物有限公司)说明书操作，96孔板中加入标准品和待测样品，37 ℃孵育2 h，弃液体；加入生物素标记抗体工作液，37 ℃孵育1 h，洗涤；加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，37 ℃孵育1 h，洗涤；加入底物溶液，37 ℃避光显色15~30 min；加入终止溶液终止反应；使用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度值。
1.7 胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR)计算心脏穿刺取血，用快速生化血糖仪(拜安捷，德国拜耳公司)检测各组大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FPG）。计算HOMA-IR = [空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)×FPG] /22.5。
1.8 统计学分析采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计量资料用x±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 宫内营养不良对IUGR子鼠生长及胰腺发育的影响IUGR组大鼠出生BW明显低于CON组，这种情况一直持续至生后3周，哺乳期后，IUGR组出现生长追赶，至12周时，IUGR组与CON组BW无统计学差异(P = 0.37）。IUGR组大鼠胰腺质量(pancreas weight，PW)及胰腺质量/BW比值(pancreas weight/body weight ratio，PW/BW)在生后1 d及1、3、12周时均低于CON组，差异有统计学意义(P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01，P = 0.01）。见表 1。
| Time after birth | BW(g) | PW(g) | PW/BW(‰) |
| 1 day | |||
| CON group | 6.71±0. 49 | 16.15±1.46 | 2.42±0.32 |
| IUGR group | 4.72±0.102) | 10.53±1.3922) | 2.17±0.191) |
| 1 week | |||
| CON group | 15.84±0.88 | 37.16±1.91 | 2.35±0.03 |
| IUGR group | 11.60±0.752) | 25.20±1.862) | 2.17±0.022) |
| 3 weeks | |||
| CON group | 51.18±2.64 | 254.28±8.95 | 4.96±0.16 |
| IUGR group | 44.00±1.752) | 197.76±11.412) | 4.47±0.112) |
| 12 weeks | |||
| CON group | 446.08±14.35 | 2 610.49±106.91 | 5.86±0.38 |
| IUGR group | 455.19±18.84 | 2 321.48±195.671) | 5.09±0.222) |
| 1)P < 0.05 vs CON group；2)P < 0.01 vs CON group. BW，body weight；PW，pancreas weight. | |||
HE染色结果显示，与CON组相比，新生IUGR大鼠胰岛组织松散，胰岛面积明显低于对照组。生后1、3、12周时，IUGR组胰岛细胞团体积亦小于CON组。见图 1。
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| 图 1 CON组和IUGR组胰腺组织HE染色结果×400 Fig.1 HE staining of rats pancreas in CON and IUGR groups ×400 |
进一步通过免疫荧光双染的方法测定子鼠胰岛β细胞增殖情况，其中Ki-67和insulin共表达的部分即提示胰岛β细胞增殖。结果表明，在生后1 d及1、3、12周时，IUGR组胰岛β细胞增殖水平明显低于CON组(P < 0.01）。见图 2。
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| A to D, immunofluorescent staining result of insulin and Ki-67(×400);E, the ratio of proliferative islet cells was calculated as Ki-67+ β-cells/total number of β-cells. A, postnatal 1 day; B, postnatal 1 week; C, postnatal 3 weeks; D, postnatal 12 weeks. *P < 0.01 vs CON group. 图 2 CON组和IUGR组胰腺免疫荧光双染结果(n = 5) Fig.2 Immunofluorescent staining of rats' pancreas in CON and IUGR groups (n = 5) |
2.2 宫内营养不良对IUGR大鼠胰岛功能的影响
不同时间点2组大鼠FPG、FINS及HOMA-IR的结果如表 2所示，出生后1 d、1周、3周时，IUGR组大鼠FPG水平、FINS水平及HOMA-IR与CON组比较无统计学差异。生后12周，IUGR组大鼠FPG水平虽略高于CON组，但无统计学差异；而其FINS水平及HOMA-IR显著高于CON组，差异有统计学意义(P < 0.01）。提示IUGR大鼠在生后12周时存在高胰岛素血症及胰岛素抵抗。
| Time after birth | FPG(mmol/L) | FINS(mIU/L) | HOMA-IR |
| 1 d | |||
| CON group | 4.38±0.17 | 1.47±0.24 | 0.29±0.06 |
| IUGR group | 4.30±0.26 | 1.62±0.09 | 0.31±0.04 |
| 1 week | |||
| CON group | 5.28±0.37 | 3.27±0.53 | 0.76±0.07 |
| IUGR group | 5.18±0.12 | 2.98±0.52 | 0.69±0.13 |
| 3 weeks | |||
| CON group | 5.52±0.26 | 6.11±0.53 | 1.49±0.07 |
| IUGR group | 5.60±0.45 | 6.45±0.54 | 1.60±0.16 |
| 12 weeks | |||
| CON group | 5.68±0.41 | 9.50±0.32 | 2.39±0.25 |
| IUGR group | 6.03±0.42 | 12.72±1.411) | 3.18±0.161) |
| 1)P < 0.01 vs CON group. FPG，fasting blood glucose；FINS，fasting insulin；HOMA-IR，homeostasis model assessment-insulin resistance index. | |||
2.3 IUGR大鼠胰腺中OPG蛋白及mRNA的表达情况
Western blotting和实时PCR结果显示，生后1 d及1、3、12周时，IUGR组OPG蛋白及mRNA的表达水平均低于CON组，其中生后1 d及12周的差异尤为显著(P < 0.01）。见图 3、4。
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| *P < 0.05, **P < 0.01 vs CON group. 图 3 CON组和IUGR组大鼠胰腺组织OPG蛋白表达(n = 6) Fig.3 OPG protein expression in pancreas of rats in CON and IUGR groups(n = 6) |
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| *P < 0.05, **P < 0.01 vs CON group. 图 4 CON组和IUGR组大鼠胰腺组织OPG mRNA表达(n = 5) Fig.4 OPG mRNA expression in pancreas of rats in CON and IUGR groups(n = 5) |
3 讨论
胎盘发育异常、宫内乏氧及宫内营养不良等均会导致胎儿IUGR[12-13]。胎儿期与新生儿早期胰岛β细胞分裂加快、数目增多，这一过程受营养物质的调节，营养物质的数量或质量是保证胰岛β细胞发育的基础。雌性大鼠妊娠期给予低蛋白饮食可使新生大鼠生长发育迟缓，并影响胎鼠胰岛β细胞大小、增殖及功能成熟，造成β细胞缺陷。本研究发现，在生长发育的各个阶段，IUGR大鼠的胰腺发育均较对照组迟缓，表现为胰腺质量低、胰岛细胞团体积减小、胰岛β细胞增殖水平下降。
胰岛β细胞的数量和功能与糖尿病的发生有密切的关系。IUGR个体胰岛β细胞缺陷在2型糖尿病发生中的作用一直受学者关注[14]。临床研究[15-16]也发现，IUGR的患儿在儿童期和成人期会出现胰岛素敏感性下降或胰岛素抵抗。本研究发现，IUGR大鼠在生后12周时出现了高胰岛素血症及胰岛素抵抗。
近年来的研究表明，OPG与糖尿病密切相关。2型糖尿病患者血中OPG水平明显高于对照组[17]，但机制尚不清楚，可能与胰岛素抵抗的炎症状态有关[18]，也可能与糖尿病血管病变有关[19]。OPG及其配体核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)在肝脏中均有表达[20]。RANKL可与核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor κB，RANK)结合，激活核因子κB(factor nuclear facto κB，NF-κB)及其下游的炎症信号通路，引起肝脏胰岛素抵抗。而OPG做为RANKL的诱饵受体，竞争性地与RANKL结合，阻止NF-κB及其下游信号通路，进而改善糖代谢。这一结论在临床研究[21]中也得到了证实。
研究[6]表明，在胰腺中，白细胞介素1β(interle-ukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可介导OPG的产生，而OPG则通过抑制p38分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)的磷酸化，使胰岛β细胞免受损伤，可见OPG具有保护胰岛β细胞的作用。KONDEGOWDA等[7]认为，OPG在催乳素介导的胰岛β细胞再生中起关键的作用，可以促进幼年、老年及糖尿病大鼠胰岛β细胞增殖。而TOFFOLI等[8]则认为OPG可改变胰岛β细胞形态并造成胰岛功能损伤。本研究发现，OPG在正常大鼠及IUGR大鼠胰腺均有表达，但新生儿期(生后1 d）、幼年期(生后1周、3周)及成年期(生后12周)IUGR大鼠胰腺中OPG蛋白及mRNA水平均低于同期正常大鼠。
综上所述，本研究结果表明，IUGR大鼠胰腺中OPG蛋白及mRNA表达水平下降，可能是引起其胰腺发育不良、胰岛β细胞增殖水平下降及成年期胰岛素抵抗的原因之一。
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