2020, Vol. 49文章信息
- 傅松年, 王江涛, 罗福祥, 曾贵荣, 李治建, 马丽
- Fu Songnian, Wang Jiangtao, Luo Fuxiang, ZEng Guirong, Li Zhijian, Ma Li
- 圣约翰草提取物对慢性不可预知性应激致小鼠抑郁模型的影响
- Effects of St. John's wort extract on a mouse model of chronic unpredictable stress-induced depression
- 中国医科大学学报, 2020, 49(8): 706-710, 715
- Journal of China Medical University, 2020, 49(8): 706-710, 715
-
文章历史
- 收稿日期：2019-09-10
- 网络出版时间：2020-07-29 8:33
引用本文 |
2. 新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所毒理学研究室, 乌鲁木齐 803349;
3. 新药药效与安全性评价湖南省重点实验室, 长沙 410331
2. Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine, Laboratory of Toxicology, Urumqi 803349, China;
3. Hunan Key Laboratory of Pharmacodynamics and Safety Evaluation of New Drugs, Changsha 410331, China
圣约翰草，中药名贯叶金丝桃，为藤黄科植物贯叶金丝桃的干燥地上部分。辛，寒。归肝经，具有疏肝解郁，清热利湿，消肿通乳的功效。用于肝气郁结，情志不畅，心胸郁闷，关节肿痛，乳痈，乳少[1]。圣约翰草中含有抗抑郁成份贯叶金丝桃素、金丝桃素、伪金丝桃素和金丝桃苷等。目前，圣约翰草提取物在临床上被广泛应用于治疗轻中度抑郁障碍，疗效显著[2]，并已获得国内外指南的一致推荐[3]。本研究采用慢性不可预知性温和应激法建立小鼠抑郁模型，采用自主活动悬尾行为学测试检测血清中5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲肾上腺素(noradrenaline，NE)的水平及脑海马区病理学检查，探讨圣约翰草提取物对抑郁模型小鼠抗抑郁的作用及其机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物雄性ICR小鼠70只，体质量18.0~22.0 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002。饲养于新疆维吾尔医药研究所SPF级实验室中，饲养温度20~26 ℃，湿度40%~70%，实验动物使用许可证号：SCXK(新)2018-0001。
1.2 药物及试剂圣约翰草提取物，规格：每片质量0.56 g，含圣约翰草(贯叶金丝桃)提取物306 mg，批号0070417，有效期至2020年1月。盐酸氟西汀分散片，规格：20 mg(以氟西汀计），批号7339A，分包装批号7339AA，有效期至2019年8月。购自礼来苏州制药有限公司。
1.3 主要仪器AX4201ZH/E型电子天平[奥豪斯仪器(常州)有限公司，ME2002E型电子天平，BEHAV动物行为机能系统(上海吉量科技有限公司），小动物悬尾测试仪(成都泰盟科技技术有限公司产品），TDL-5-A型低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂），MULTISKAN FC酶标仪(美国Thermo公司），TP1020生物组织自动脱水机(德国莱卡公司），KD-BM/BLⅡ生物组织自动包埋机(浙江金华科迪仪器设备有限公司），RM2235切片机(德国莱卡公司），KD-T电脑生物组织摊烤片机(浙江金华科迪仪器设备有限公司），DM4000型光学显微镜(德国莱卡公司）。
1.4 实验方法 1.4.1 慢性不可预知性温和应激法致小鼠抑郁模型的建立雄性ICR小鼠70只，体质量18.0~22.0 g，除正常对照组外，其余小鼠采用慢性不可预知性温和应激法制备小鼠抑郁模型。实验过程中采用禁食、禁水(12 h）、昼夜颠倒(12 h/12 h），强迫游泳(10 min）、噪声(30 min）、频闪(12 h）、动物束缚(12 h)（置于50 mL离心管内，管直径为3.0 cm，长约10 cm，管壁有6~7个直径为0.5 mm的通风口，束缚期间动物禁食禁水）、湿笼(12 h）、倾笼(12 h），每天随机采取2~3种不同方式进行不规律刺激，连续4周。
1.4.2 分组与给药动物连续造模4周后根据糖水偏爱检测结果将动物随机分为正常对照组、模型对照组、盐酸氟西汀组[2.6 mg/(kg·d)]、圣约翰草提取物低、中、高剂量组[0.2 g/(kg·d）、0.4 g/(kg·d）、0.8 g/(kg·d)]。正常对照组和模型对照组每天给予纯水灌胃，其余各组分别给予相应药液，给药体积为20 mL/kg，连续给药4周，除正常对照组外，各组于给药后1 h继续进行慢性不可预知性温和应激刺激。
1.4.3 糖水偏爱测试糖水偏爱测试分为训练期和测试期。测试前2 d作为训练期，使动物充分适应蔗糖饮水，第1个24 h给予动物2瓶1%蔗糖水。第2个24 h也是训练期，给予小鼠1瓶1%蔗糖水，1瓶纯水。测试前不禁食，禁水8 h。测试期，同时给予小鼠1瓶1%蔗糖水，1瓶纯水，测试15 h内动物分别饮用糖水和纯水水量。测试中间，将2个瓶子位置互换以避免位置偏爱影响因素。测试结束，计算糖水偏爱指数(糖水偏爱指数=糖水消耗/总液体消耗×100%）。
1.4.4 空场测试给药结束后将动物放入测试箱中，适应3 min后开始检测，检测10 min内小鼠自发活动。
1.4.5 悬尾测试将小鼠倒置，尾部固定于悬尾装置上，头部距桌面约5 cm，使小鼠前后左右均无攀抓的地方，小鼠间有挡板隔开视线，防止互相干扰，检测每只动物5 min的活动情况。
1.4.6 ELISA法检测小鼠血清指标行为学检测结束后，对动物禁食，次日眼眶取血，分离血清，ELISA法检测圣约翰草提取物对小鼠血清中5-HT、NE含量的影响。
1.4.7 海马组织病理学观察行为学测试结束后，灌流固定取海马组织，石蜡切片，染色、脱水、透明及封固后，光镜观察海马组织神经元形态并拍照。
1.5 统计学分析采用SPSS 16.0进行统计分析，计量资料采用x±s表示，多组间比较用one-way ANOVA分析，先进行方差齐和正态性比较，方差齐且符合正态性时采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 圣约翰草提取物对小鼠糖水偏爱的影响与正常对照组比较，模型对照组小鼠糖水偏爱指数明显降低(P < 0.05）。与模型对照组比较，盐酸氟西汀组，圣约翰草提取物低、中、高剂量组小鼠糖水偏爱指数显著升高(P < 0.01）。见表 1。
| Group | Dosage(mg/kg) | Sugar water preference index(%) |
| Normal control | - | 60.6±3.4 |
| Model control | - | 53.8±5.91) |
| Fluoxetine hydrochloride | 2.6 | 60.4±5.72) |
| St. John’s wort extract low dose | 200.0 | 61.6±4.12) |
| St. John’s wort extract medium dose | 400.0 | 65.4±4.22) |
| St. John’s wort extract high dose | 800.0 | 62.0±6.62) |
| 1)P < 0.05，compared with normal control group；2)P < 0.01，compared with model control group. | ||
2.2 圣约翰草提取物对小鼠空场活动的影响
与正常对照组比较，模型对照组小鼠自主活动总路程、平均速度均明显减少(P < 0.05）、活动时间显著减少(P < 0.01），休息时间显著增加(P < 0.01）。与模型对照组比较，圣约翰草提取物低、中、高剂量组小鼠总路程、平均速度、活动时间均明显降低(P < 0.05），休息时间显著增加(P < 0.05或P < 0.01）。见表 2。
| Group | Dosage(mg/kg) | Total distance(mm) | Average velocity(mm/s) | Rest time(s) | Activity time(s) |
| Normal control | - | 59 959±40 977 | 99.9±68.3 | 57.7±26.0 | 542.3±26.0 |
| Model control | - | 30 985±15 0841) | 51.6±25.11) | 108.9±51.42) | 491.1±51.42) |
| Fluoxetine hydrochloride | 2.6 | 47 904±17 408 | 79.8±29.03) | 41.1±33.74) | 558.9±33.73) |
| St. John’s wort extract low dose | 200.0 | 50 323±15 3533) | 73.2±21.53) | 42.3±21.53) | 548.7±12.63) |
| St. John’s wort extract medium dose | 400.0 | 54 383±29 2243) | 90.6±48.73) | 31.0±17.54) | 569.0±17.53) |
| St. John’s wort extract high dose | 800.0 | 50 668±13 8963) | 84.4±23.23) | 33.3±22.14) | 566.7±22.13) |
| 1)P < 0.05，2)P < 0.01，compared with normal control group；3)P < 0.05，4)P < 0.01，compared with model control group. | |||||
2.3 圣约翰草提取物对小鼠悬尾活动的影响
与正常对照组比较，模型对照组小鼠活动静止时间显著延长(P < 0.01）。与模型对照组比较，圣约翰草提取物低、中、高剂量组均能显著缩短静止时间(P < 0.05或P < 0.01），且与盐酸氟西汀组作用相当。见表 3。
| Group | Dosage(mg/kg) | Rest time(s) |
| Normal control | - | 29.4±36.1 |
| Model control | - | 81.0±56.71) |
| Fluoxetine hydrochloride | 2.6 | 30.7±44.52) |
| St. John’s wort extract low dose | 200.0 | 56.3±75.53) |
| St. John’s wort extract medium dose | 400.0 | 31.3±17.82) |
| St. John’s wort extract high dose | 800.0 | 46.8±28.02) |
| 1)P < 0.01，compared with normal control group；2)P < 0.01，3)P < 0.05，compared with model control group. | ||
2.4 圣约翰草提取物对小鼠血清5-HT、NE含量的影响
与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清中5-HT、NE含量明显降低(P < 0.05）。与模型对照组比较，圣约翰草中、高剂量组小鼠血清中5-HT含量明显升高(P < 0.05)；圣约翰草中、高剂量组小鼠血清中NE含量明显升高(P < 0.05）。见表 4。
| Group | Dosage(mg/kg) | 5-HT(ng/mL) | NE(ng/mL) |
| Normal control | - | 610.36±105.22 | 7.46±0.89 |
| Model control | - | 484.54±102.261) | 6.04±1.171) |
| Fluoxetine hydrochloride | 2.6 | 570.11±154.64 | 6.82±1.30 |
| St. John’s wort extract low dose | 200.0 | 584.60±130.11 | 6.80±1.97 |
| St. John’s wort extract medium dose | 400.0 | 652.30±127.222) | 7.14±1.98 |
| St. John’s wort extract high dose | 800.0 | 665.01±173.302) | 7.55±1.672) |
| 1)P < 0.05，compared with normal control group；2)P < 0.05，compared with model control group. | |||
2.5 小鼠海马锥体细胞萎缩、变性评分
与正常对照组比较，模型对照组小鼠海马锥体细胞萎缩、变性，主要处于重度损害状态，且动物只数较多。与模型对照组比较，圣约翰草提取物低、中、高剂量组小鼠海马锥体细胞主要处于正常和轻度损害，且正常状态较多；圣约翰草提取物高剂量组有部分小鼠海马锥体细胞处于轻度损害；盐酸氟西汀组小鼠海马锥体细胞主要处于轻度损害，且动物只数较多。评分标准：对大脑海马损伤情况进行评分，按照海马锥体细胞萎缩、变性程度分为0分，正常；1分，轻度损害(病变 < 20%)；2分，中度损害(病变20%~40%)；3分，重度损害(病变 > 40%），见表 5。
| Group | Dosage(mg/kg) | Specific index score of hippocampal pyramidal cell atrophy and degeneration | |||
| 0 | 1 | 2 | 3 | ||
| Normal control | - | 7 | 1 | 1 | 1 |
| Model control | - | 2 | 2 | 1 | 5 |
| Fluoxetine hydrochloride | 2.6 | 3 | 6 | 1 | 0 |
| St. John’s wort extract low dose | 200.0 | 5 | 3 | 1 | 1 |
| St. John’s wort extract medium dose | 400.0 | 6 | 3 | 1 | 0 |
| St. John’s wort extract high dose | 800.0 | 3 | 4 | 1 | 2 |
2.6 海马组织病理学检查
与正常对照组比较，模型对照组小鼠海马组织神经元损伤程度较重，表现为海马锥体细胞排列不规则，部分神经元丢失、锥体细胞萎缩、变性及数量减少，主要处于重度损害状态(病变 > 40%)；与模型对照组比较，圣约翰草低、中、高剂量组均能逆转以上改变，可见小鼠海马组织神经元损伤程度较轻，表现为海马椎体细胞排列较为规则，细胞膜结构较完整，细胞核形态正常，主要处于正常状态，少数处于轻度损害(病变 < 20%），见图 1。
|
| A，normal control group；B，model control group；C，fluoxetine hydrochloride group；D，low dose group；E，medium dose group；F，high dose group. 图 1 圣约翰草提取物对抑郁症模型小鼠海马组织神经元的影响HE×200 Fig.1 Effect of St. John's wort extract on the neurons in the hippocampal tissue of depression model mice HE×200 |
3 讨论
慢性不可预知性模型是目前研究抑郁模型常用疾病模型之一，该模型稳定性与重复性好，能更好地模拟人类在社会环境中面临的高压、孤独、拥挤等应激因素，因此被广泛用于抑郁症发病机制和抗抑郁药物的药理学研究[4-5]。快感缺失是抑郁症的一个典型症状，糖水偏爱实验多用于评价快感缺失的经典行为学检测实验。空场实验是经典的情绪相关行为学检测实验，用于评价动物的好奇和自我探索行为。悬尾实验检测绝望行为，是抗抑郁药物初筛以及检测模型动物是否出现“抑郁样”行为的常用检测实验[6-7]。本研究结果表明，慢性不可预知性小鼠模型动物表现出糖水偏爱指数降低、小鼠自主活动测试中的休息时间增加，悬挂测试中的不动时间增加，提示造模成功。圣约翰草提取物能明显改善慢性不可预知致小鼠行为学改变，主要表现在升高小鼠糖水偏爱指数、减少小鼠自主活动测试中的休息时间，减少悬挂测试中的不动时间。
目前临床上主要以5-HT、NE重吸收抑制剂作为抑郁症治疗的首选药物，此类药物可通过阻断5-HT或NE重吸收，提升其在突触间隙的浓度，进而有效缓解病情[8]。中枢神经递质在调节情绪、学习和记忆方面起着重要作用。慢性应激可影响单胺类神经递质含量，导致应激小鼠海马组织5-HT、NE水平降低，相关研究表明圣约翰草提取物能够均衡地抑制再摄取泵对5-HT、NE的再摄取，使此两种神经递质在突触前膜的重吸收减少。反馈性地增加神经递质的合成与释放，致其在突触间隙的浓度增加[9-11]。本研究结果表明，模型对照组小鼠海马中5-HT、NE含量等明显低于正常小鼠，圣约翰草提取物能够明显提高抑郁模型小鼠血清中5-HT、NE的水平，其结果与文献报道一致。海马体是脑组织边缘系统的重要组成部分，与情感和记忆有关，海马对调节情绪、学习和记忆、行为等起重要作用，也是应激反应的高位调节中枢。临床抑郁患者海马组织萎缩、神经元减少[12]，研究[13]表明长期慢性应激能损伤小鼠海马神经元，主要表现在海马神经元细胞减少，本研究结果显示，慢性不可预知性小鼠模型小鼠海马组织细胞排列稀疏紊乱，部分椎体出现细胞坏死，海马神经元减少，圣约翰草提取物能明显改善海马组织病理改变[14-15]。提示圣约翰草提取物可改善抑郁小鼠海马组织神经元的损伤。
综上所述，圣约翰草提取物的抗抑郁作用可能与增加调节血清中5-HT、NE浓度，减轻海马组织神经元损伤有关。
| [1] |
国家药典委员会. 中华人民共和国药典(2015年版四部)[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015.
|
| [2] |
NG QX, VENKATANARAYANAN N, HO CYX. Clinical use of hypericum perforatum (St John's wort) in depression:a meta-analysis[J]. J Affect Disord, 2017, 210: 211-221. DOI:10.1016/j.jad.2016.12.048 |
| [3] |
LINDE K, BERNER MM, KRISTON L. St John's wort for major depression[J]. Cochrane Database Syst Rev, 2008(4): CD000448. DOI:10.1002/14651858.CD000448.pub3 |
| [4] |
江开达. 精神病学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2010.
|
| [5] |
DENNIS CL, DOWSWELL T. Interventions (other than pharmacological, psychosocial or psychological) for treating antenatal depression[J]. Cochrane Database Syst Rev, 2013(7): CD006795. DOI:10.1002/14651858.CD006795.pub3 |
| [6] |
王佳, 张磊, 袁靖姣, 等. 慢性不可预知性应激刺激后大鼠行为学的改变[J]. 中国健康心理学杂志, 2016, 24(5): 674-677. DOI:10.13342/j.cnki.cjhp.2016.05.009 |
| [7] |
荆然, 李慧峰, 程艳刚, 等. 五味子不同炮制品对小鼠慢性不可预知性应激抑郁的改善作用[J]. 现代药物与临床, 2016, 31(11): 1698-1702. DOI:10.7501/j.issn.1674-5515.2016.11.003 |
| [8] |
FINBERG JPM. Update on the pharmacology of selective inhibitors of MAO-A and MAO-B:focus on modulation of CNS monoamine neurotransmitter release[J]. Pharmacol Ther, 2014, 143(2): 133-152. DOI:10.1016/j.pharmthera.2014.02.010 |
| [9] |
MÜLLER WE, SINGER A, WONNEMANN M, et al. Hyperforin represents the neurotransmitter reuptake inhibiting constituent of Hypericum extract[J]. Pharmacopsychiatry, 1998, 31(Suppl 1): 16-21. DOI:10.1055/s-2007-979341 |
| [10] |
SINGER A, WONNEMANN M, MULLER WE. Hyperforin, a major antidepressant constituent of St. John's wort, inhibits serotonin uptake by elevating free intracellular Na+11[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1999, 290(3): 1363-1369. DOI:10.1002/9781118606803.ch4 |
| [11] |
王高华, 李凌江, 谢鹏, 等. 圣约翰草提取物片治疗抑郁障碍专家共识[J]. 临床精神医学杂志, 2018, 28(4): 285-288. DOI:10.3969/j.issn.1005-3220.2018.04.024 |
| [12] |
刘春林, 阮克锋, 高君伟, 等. 抑郁症的多机制发病[J]. 生理科学进展, 2013, 44(4): 253-258. |
| [13] |
MACQUEEN GM, CAMPBELL S, MCEWEN BS, et al. Course of illness, hippocampal function, and hippocampal volume in major depression[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(3): 1387-1392. DOI:10.1073/pnas.0337481100 |
| [14] |
王睿, 费洪新, 王琪, 等. 补阳还五汤对慢性不可预知性温和应激抑郁模型小鼠行为及脑海马CA3区病理形态学影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2017, 23(1): 158-162. DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2017010158 |
| [15] |
傅松年, 王江涛, 罗福祥, 等. 贯叶金丝桃提取物对慢性不可预知性温和应激致小鼠抑郁的改善作用[J]. 中华行为医学与脑科学杂志, 2019, 28(10): 915-920. DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-6554.2019.10.010 |