2020, Vol. 49文章信息
- 张海涛, 韦薇, 齐弘炜, 袁彪, 汤楚中
- ZHANG Haitao, WEI Wei, QI Hongwei, YUAN Biao, TANG Chuzhong
- microRNA-486对低氧导致的原代大鼠心肌细胞损伤和凋亡的改善作用
- microRNA-486 improves hypoxia-induced injury and apoptosis of primary cardiomyocytes in rats
- 中国医科大学学报, 2020, 49(6): 500-504
- Journal of China Medical University, 2020, 49(6): 500-504
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文章历史
- 收稿日期：2019-09-10
- 网络出版时间：2020-05-18 15:00
引用本文 |
2. 承德医学院附属医院血液检验室, 河北 承德 067000;
3. 首都医科大学附属北京同仁医院心脏外科, 北京 100730;
4. 中国人民解放军总医院第六医学中心心脏外科, 北京 100048
2. Department of Hematology Laboratory, Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, China;
3. Cardiovascular Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing 100730, China;
4. Department of Cardiac Surgery, The Sixth Medical Center of PLA General Hospital, Beijing 100048, China
缺血性心脏病是最严重的心血管疾病之一，其病理生理机制以及心肌细胞缺血适应机制尚未完全阐明。有证据表明，微小RNA（microRNA，miRNA）可能在缺血性心脏病中发挥关键作用[1-2]。miRNA是一类在转录后基因调控中发挥功能的非编码小RNA，miRNA在缺血性心脏病发病机制和进展的过程中起关键的调节作用[3-4]。miR-486是心脏高丰度表达的重要miRNA之一，有研究[5]表明，miR-486在携带MRTF-A重组腺病毒转染的新生大鼠心肌细胞表达的多种miRNA中最为突出。而MRTF-A在心肌缺血期间，是调控心肌细胞纤维化的重要转录因子。因此，miR-486的表达调控与心肌缺血和预后有明显相关性，但是miR-486在心肌细胞中的作用目前尚不清楚。因此，本研究拟利用腺病毒介导的基因高表达和沉默技术，初步研究miR-486在心肌细胞缺氧损伤中的作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物1~2日龄的清洁级SD大鼠乳鼠15只，购于北京科宇动物养殖中心。
1.2 主要试剂和仪器miRNA提取试剂盒、miRNA反转录试剂盒、miRNA-486荧光探针、实时荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司），腺病毒ad-miR-486、腺病毒ad-miR-486-antago（上海汉恒生物公司），乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司），CCK-8试剂盒（中国东仁化学科技有限公司），AnnexinⅤ/PI试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），细胞培养箱、紫外分光光度计（美国赛默飞世尔科技有限公司），低氧培养箱（英国Ruskinn公司），酶标仪（美国分子仪器公司），流式细胞仪（美国BD公司）。
1.3 乳鼠心肌细胞的分离培养取出生1~2 d的SD大鼠乳鼠15只，消毒后在无菌条件下取出乳鼠心脏，除去心包等多余组织，将心室剪成约1 mm3均匀大小的组织块，并用0.125%胰蛋白酶在37 ℃水浴锅中重复消化4次（每次约10 min）。吸取后3次消化的细胞悬液于离心管内，添加含有10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化。离心后去上清液，将细胞悬液重新悬浮到含10%胎牛血清的DMEM培养基，均匀接种于75 mL的培养瓶中，于37 ℃培养箱（含5% CO2和95% O2）中培养，差速贴壁法去除成纤维细胞，调整细胞浓度后接种于培养板上，于37 ℃细胞培养箱（含5% CO2和95%空气）中继续培养，孵育36 h后进行实验。
1.4 实时荧光定量PCR检测细胞miR-486水平制备单细胞悬液接种于6孔板，1×105/孔。当细胞生长达到80%融合时，将细胞分成6组，分别为常氧培养对照组、低氧培养6 h组、低氧培养12 h组、低氧培养24 h组、低氧培养36 h组、低氧培养48 h组，取各组细胞，吸弃培养基后，按照ABI miRNA分离试剂盒说明书操作，提取miRNA，紫外分光光度计测定miRNA浓度和纯度，采用U6作为内参，用特异性miR-486反转录引物和U6内参反转录引物进行反转录获取cDNA。用ABI公司的miR-486探针对原代心肌细胞中miR-486的表达进行测定。使用实时荧光定量PCR仪（ABI 7900，美国应用生物系统公司）进行实验，获得Ct值后，应用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。
1.5 细胞活力、损伤和凋亡程度的测定将1.4中达到80%融合度的心肌细胞按照转染Ad-miR-486和Ad-miR-486-antago，分成6组，分别为常氧培养组（C+N组）、转染ad-miR-486+常氧培养组（M+N组）、转染ad-miR-486-antago+常氧培养组（I+N组）、低氧培养组（C+H组）、转染ad-miR-486+低氧培养组（M+H组）、转染ad-miR-486-antago+低氧培养组（I+H组），用无血清不含抗生素的DMEM培养液分别稀释待转染的ad-miR-486和ad-miR-486-antago。将脂质体Lipofectamine 2000与待转染试剂混匀，室温静置20 min后，加入相对应的各组细胞中。C+N组、M+N组、I+N组置于常氧培养箱（37 ℃，含5% CO2和95%空气）中孵育；C+H组、M+H组、I+H组置于低氧培养箱（37 ℃，含1% O2、94% N2和5% CO2）中孵育。48 h后，收集各组细胞进行下列指标的检测。
1.5.1 CCK-8法测定心肌细胞活性随机选取各组心肌细胞，每孔培养基按照10:1的比例避光加入CCK-8试剂，37 ℃下在培养箱内避光培养3 h，应用酶标仪于450 nm波长处测定光密度（optical density，OD）值，间接反映心肌细胞活力。计算细胞活力，细胞活力（%）=（OD实验孔-OD调零孔）/（OD常氧培养孔-OD调零孔）×100。
1.5.2 培养液LDH活性的测定吸取各组细胞上清液，按照LDH活性检测试剂盒说明，用酶标仪测定各组还原型辅酶Ⅰ在反应过程中340 nm处OD值，计算细胞培养液LDH活性。
1.5.3 流式细胞术检测心肌细胞凋亡吸净各组细胞培养液，加入不含EDTA的0.25%胰酶消化至细胞形态为圆形时，轻轻吹打使细胞脱落，加入DMEM培养液终止消化后收集细胞，1 000 r/min离心5 min，PBS漂洗2次后，用300 μL的1×Binding buffer重悬，调整细胞浓度约1×105/mL，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL碘化丙啶，混匀后避光孵育10 min，用流式细胞仪测定细胞凋亡率。
1.6 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 低氧培养心肌细胞miR-486表达水平的变化从SD大鼠乳鼠中分离心肌细胞并培养扩增，依次于低氧培养箱（37 ℃，1% O2、94% N2、5% CO2）中培养6、12、24、36、48 h后收取，抽提细胞RNA，利用实时荧光定量PCR测定miR-486表达变化。常氧培养对照组、低氧培养6 h组、低氧培养12 h组、低氧培养24 h组、低氧培养36 h组、低氧培养48 h组中，miR-486的表达水平分别为1.03±0.27、1.16±0.22、1.65±0.31、2.52±0.72、1.66±0.24、1.45±0.04。随着低氧培养时间的延长，miR-486的表达逐渐上升，至24 h达到峰值后逐渐下降，低氧培养12、24、36 h组miR-486表达量明显高于常氧培养对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。
2.2 心肌细胞培养液LDH活性的比较6组比较，心肌细胞培养液LDH活性的差异有统计学意义（F = 72.759，P < 0.01）。心肌细胞在常氧环境中培养，转染ad-miR-486和ad-miR-486-antago可略增加LDH释放量，但M+N组、I+N组与C+N组比较无统计学差异（P > 0.05）。低氧环境中培养的心肌细胞（C+H组、M+H组、I+H组）较常氧环境中心肌细胞（C+N组、M+N组、I+N组）LDH释放量明显增加（P < 0.05）。在低氧环境中转染了ad-miR-486的M+H组较C+H组、I+H组LDH释放量明显下降（P < 0.05），且转染了ad-miR-486-antago的I+H组LDH释放量高于C+H组，差异有统计学意义（P < 0.05），见表 1。
| Group | LDH activity（U/L） | Cell viability（%） | Rate of apoptosis（%） |
| C+N | 4.13±2.72 | 20.78±1.93 | 4.11±1.07 |
| M+N | 8.47±4.43 | 20.78±1.71 | 3.25±1.44 |
| I+N | 7.53±2.49 | 20.60±2.31 | 3.06±1.25 |
| C+H | 89.55±14.841），2），3） | 12.81±2.301），2），3） | 11.90±1.061），2），3） |
| M+H | 32.37±13.561），2），3），4） | 17.87±2.284） | 9.13±1.101），2），3），4） |
| I+H | 128.77±15.221），2），3），4），5） | 7.75±1.111），2），3），4），5） | 21.33±2.051），2），3），4），5） |
| 1）P < 0.05 vs C+N group；2）P < 0.05 vs M+N group；3）P < 0.05 vs I+N group；4）P < 0.05 vs C+H group；5）P < 0.05 vs M+H group. | |||
2.3 心肌细胞活力的比较
6组比较，心肌细胞活力的差异有统计学意义（F = 29.384，P < 0.01）。低氧环境中C+H组和I+H组较其他4组心肌细胞活力明显降低（P < 0.05），且转染了ad-miR-486的M+H组较C+H组、I+H组心肌细胞活力明显升高（P < 0.05），转染了ad-miR-486-antago的I+H组较C+H组心肌细胞活力明显下降（P < 0.05）。见表 1。
2.4 各组心肌细胞凋亡率的比较6组比较，心肌细胞凋亡率的差异有统计学意义（F = 80.302，P < 0.01）。常氧环境中转染ad-miR-486和ad-miR-486-antago可略增加心肌细胞的凋亡率，但M+N组、I+N组与C+N组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）。低氧环境中培养的心肌细胞（C+H组、M+H组、I+H组）较在常氧环境中心肌细胞（C+N组、M+N组、I+N组）凋亡率明显升高（P < 0.05）。在低氧环境中转染了ad-miR-486-antago的I+H组心肌细胞凋亡率明显高于C+H组和M+H组（P < 0.05），且转染了ad-miR-486的M+H组细胞凋亡率明显小于C+H组（P < 0.05）。见表 1、图 1。
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| A, C+N group; B, C+H group; C, M+N group; D, M+H group; E, I+N group; F, I+H group. 图 1 流式细胞仪测定心肌细胞凋亡率 Fig.1 Determination of the rate of apoptosis of the cardiomyocytes using flow cytometry |
3 讨论
缺血性心脏病的主要病理过程是由于血管病变导致心脏血供障碍，进一步导致心肌细胞缺血、损伤和凋亡，最终导致心脏功能受损。而miRNA在这个过程中起重要作用，miRNA失调与缺血性心脏病的发生和发病机制有关[6-8]。研究[9]表明，通过提高大鼠心肌中miR-486的表达水平，可以改善大鼠心肌梗死后心脏功能。本研究通过对大鼠原代心肌细胞低氧培养，模拟了心肌急性缺氧损伤的过程，利用腺病毒介导的基因高表达和沉默技术，提高和降低了心肌细胞中miR-486的表达水平，并通过一系列实验证实低氧条件下miR-486能够降低LDH活性、增强心肌细胞活力、降低细胞凋亡率，从而改善低氧导致的心肌细胞损伤和凋亡。
本研究证实miR-486是心肌细胞中缺氧诱导的miRNA，通过实时荧光定量PCR证实在低氧状态下心肌细胞内miR-486表达显著提高，但其对心肌细胞低氧损伤过程的保护机制尚不明确。利用TargetScan网络生物信息学数据库分析，预测miR-486的靶基因可能含有PTEN、FoxO1、Sirt1。其中，PTEN作为H2O2诱导的大鼠心肌细胞凋亡的负调节因子[10]，miR-486-5p可通过靶向抑制PTEN并激活PI3K/AKT信号通路来保护心肌细胞免于凋亡[11]。FoxO家族参与调节多种细胞功能，FoxO1通过转录控制丙酮酸脱氢酶激酶4的表达，调节心肌葡萄糖氧化速率[12]，其抑制作用也显著抑制成肌细胞增殖和减少成肌细胞凋亡[13]。Sirt1失活在缺血再灌注诱导的细胞凋亡中起关键作用[14]。因此，这些靶基因的抑制可能涉及miR-486对心肌细胞低氧损伤的保护作用。这在本研究中也得到了证实，低氧环境中，与C+H组比较，M+H组LDH释放和细胞凋亡率明显下降，细胞活力明显上升；而I+H组LDH释放明显增多，细胞凋亡率明显上升，细胞活力明显降低。可见，miR-486对低氧导致的心肌细胞损伤和凋亡的改善是有效的。
综上，本研究表明，miR-486对原代心肌细胞低氧状态下的损伤和凋亡有显著改善作用。miR-486可能为缺血性心脏病的基因治疗提供新的思路和实验依据。
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