胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤^[1]，可发生C-KIT和血小板衍生生长因子受体α（platelet-derived growth factor receptors-α，PDGFR-α）基因突变^[2]。大约10%~30%的GIST发生转移，是具有恶性潜能的肿瘤^[3]。准确判断GIST生物学行为是治疗的关键。迄今为止，尚没有公认的生物学指标来判断其生物学行为。

ETV4是多瘤促活化因子3（polyoma enhancer activator 3，PEA3）家族成员之一，在细胞的生长、侵袭以及转移中发挥着重要的作用^[4-5]。因此，本研究旨在探讨ETV4转录因子在GIST的表达及其与临床病理特征的关系，以及ETV4与C-KIT、PDGFR-α基因突变的关系。

1 材料与方法 1.1 标本

收集2012年至2018年2月中国医科大学附属第一医院病理科确诊为GIST的石蜡标本，共91例为实验组。同时随机选取10例实验组的癌旁正常胃肠道组织设为对照组。纳入标准：病理及免疫组化确诊，免疫组化项目包含Ki67；危险度分级明确；完整的临床病历资料；组织蜡块材料充足。排除标准：病理或免疫组化无法确诊；危险度分级不明确；不具有完整的临床病历资料；组织蜡块材料较少。

1.2 试剂及仪器

兔抗人多克隆抗体ETV4（HPA005768）购自美国Sigma公司。兔SP检测试剂盒（KIT-9710），PBS缓冲液以及DAB显色液均购于福州迈新生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化

采用免疫组化SP法，测定ETV4在GIST组织中的表达情况。标本石蜡块切片4 μm厚，在75 ℃恒温箱中放置4 h，取出后自然冷却。将切片脱蜡、水合，放置于高压水浴锅内的枸橼酸钠缓冲液中进行热修复，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，37 ℃静置30 min后，PBS缓冲液洗片3次，一次5 min，随后滴加山羊血清封闭液，37 ℃静置40 min后，滴加ETV4抗体（1:200）切片在4 ℃过夜。复温、PBS缓冲液洗片后滴加生物素标记的第二抗体，37 ℃静置30 min，PBS缓冲液洗片3次，一次5 min，随后滴加链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶，37 ℃静置30 min后，PBS缓冲液洗片后滴加DAB显色液，自来水冲洗终止显色，苏木素复染，脱水，最后用中性树胶封片。

1.3.2 基因检测

用直接测序法对所有病例进行C-KIT和PDGFR-α测序，测序由厦门艾德生物有限公司完成。

1.4 GIST术后危险度评分标准

2008年4月，美国国立卫生研究院（national institutes of health，NIH）重新发布了关于原发可切除GIST的危险度评分标准。与FLETCHER等^[6]提出的相比，增加了原发肿瘤的部位以及肿瘤破裂作为评判危险度的指标。见表 1。

1.5 结果判定

由2名病理科医师在400倍的光学显微镜下随机观察5个视野，每个视野至少计数100个完整肿瘤细胞。肿瘤细胞核中出现棕黄色染色为阳性，以阳性细胞比例得分乘以染色强度得分为最终评判得分。阳性细胞比例评分：< 5%为0分，5%~ < 25%为1分，25%~ < 50%为2分，50%~ < 75%为3分，≥75%为4分。染色强度评分：未染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。在统计学分析中，最终得分≤4分为弱阳性（+），5~8分为中等阳性（++），≥9分为强阳性（+++）。

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。计数资料应用行×列联表的χ²检验或Fisher确切概率法；相关性分析应用Spearman相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 GIST中ETV4的表达情况

在91例GIST组织中，有18例（19.8%）ETV4呈弱阳性表达，34例（37.4%）ETV4呈中等阳性表达，39例（42.9%）呈强阳性表达。见图 1。ETV4在癌旁正常组织中呈弱阳性表达。

2.2 ETV4在GIST中的表达与临床病理特征的关系

ETV4转录因子在GIST中的表达水平与患者的性别，年龄，发生部位，组织学类型无关（P > 0.05），而与肿瘤大小、核分裂像、Ki-67增殖指数有关（P < 0.05）。GIST最常见的转移部位是肝脏，在本研究中共有8例发生肝脏转移，其中6例在最初诊断时已有肝转移，ETV4转录因子表达水平与肝转移有关（P < 0.05），ETV4表达水平越高，患者发生转移的可能也越大。见表 2。此外，采用Spearman相关分析结果显示，ETV4转录因子表达水平越高，其危险度越高，并且两者具有显著正相关（r = 0.387，P < 0.001）。见表 3。

2.3 ETV4在突变型和野生型GIST的表达的相关性

在91例GIST组织中，11例发生PDGFR-α基因突变，65例发生C-KIT基因突变，其中60例发生外显子11突变，4例发生外显子9突变，1例发生外显子13突变，野生型18例，Spearman相关分析发现ETV4转录因子表达水平与C-KIT基因突变呈显著正相关（r = 0.324，P = 0.008），差异有统计学意义。此外，ETV4转录因子表达水平与突变型GIST也呈显著正相关（r = 0.325，P = 0.005），然而ETV4蛋白表达水平与PDGFR-α基因突变无关（P > 0.05）。见表 3。

3 讨论

GIST多见于50岁以上的老年人^[1]，最常发生于胃部（60%~70%），其次为小肠（25%~36%），结直肠（5%）以及食管（5%）^[7]。显微镜下大多数GIST由梭形细胞组成（70%），少数由上皮样细胞（20%）或混合细胞型（10%）构成。GIST为具有恶性潜能的肿瘤，大约10%~30%的GIST发生转移等恶性生物学行为^[3]，最常见的转移部位为肝脏（65%），其次为腹膜（21%），也可转移至骨和肺（10%），但极为罕见^[8]。因此准确判断其生物学行为是治疗GIST的关键。

ETS家族是最大的转录调控因子家族之一，其亚家族PEA3家族主要参与多种生理过程，如早期发育，器官发生和形态发生^[9]。在胚胎形成时期，ETV4广泛表达于各个组织，促进肾脏、肺、乳腺等上皮源性器官的形态发生^[4]，然而ETV4很少表达于成人的正常组织中，主要表达于乳腺癌，胃癌，前列腺癌，结肠癌和卵巢癌等肿瘤组织^[10]。大量研究^[10-14]表明，ETV4在前列腺、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌的高度表达往往提示预后不良。在本研究中，ETV4在GIST中呈中强度阳性率为80.2%，并且与肿瘤大小，核分裂像，Ki67增殖指数，肝转移有关。因此，ETV4的异常表达与GIST细胞的增殖，转移等生物学行为有关。这与ZENG等^[15]的研究结果一致。此外，本研究还发现ETV4转录因子在GIST的表达水平与肿瘤的危险度呈显著相关，ETV4转录因子表达水平越高，危险度越高。因此ETV4转录因子可与危险度一起作为临床判定GIST生物学行为的重要指标。

此外，本研究还探讨ETV4转录因子的表达与野生型，突变型GIST的关系。C-KIT以及PDGFR-α基因突变是人类患有GIST的主要原因。70%~80%的GIST有C-KIT突变，最常见的是外显子11突变，而5%~10%GIST存在PDGFR-α突变^[16]。对于既没有C-KIT基因突变，也没有PDGFR-α基因突变的GIST为野生型GIST^[17]。在本研究中，突变型GIST中ETV4呈中强度阳性率为86.3%，并且ETV4转录因子的表达水平与突变型GIST显著相关，发生C-KIT基因突变的GIST中ETV4呈中强度阳性率为86.2%，并且ETV4转录因子的表达水平与C-KIT基因突变具有显著相关，然而ETV4转录因子的表达水平与PDGFR-α基因突变无关。因此，ETV4转录因子的表达水平与C-KIT基因有关。RAN等^[18]研究报道PEA3家族另一成员ETS变异体1通过结合KIT增强子区域从而正调节KIT的表达水平，促进肿瘤的发生发展。大量研究^{[11, 19-20]}表明，PEA3家族具有很高的序列同源性以及相似的高度保守的DNA结合结构域，然而调节C-KIT表达的是否是这组同源序列或者DNA结合结构域目前尚不清楚，仍需要进一步的研究。

综上所述，GIST的生物学行为除了依靠肿瘤大小，核分裂像来判断外，ETV4转录因子的表达也可以作为生物学指标，以便综合性地判断GIST的生物学行为，更有助于指导治疗。此外，ETV4转录因子的表达水平，还与C-KIT突变型GIST显著相关，为GIST的治疗提供新的方向和思路。