免疫系统失衡是人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染致病及疾病发生发展的重要原因^[1]。作为适应性免疫的重要组成部分，CD4⁺ T细胞可通过分泌多种细胞因子辅助细胞及体液免疫应答，被称为辅助性T细胞。依据分泌细胞因子的不同，CD4⁺ T细胞分为Ⅰ型辅助性T细胞（type Ⅰ helper T cell，Th1）及Ⅱ型辅助性T细胞（type Ⅱ helper T cell，Th2）2个亚群。Th1细胞主要分泌白细胞介素（interleukin，IL）-2、γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子等，参与调节细胞免疫；Th2细胞分泌IL-4、IL-6、IL-10等，主要调节体液免疫^[2]。以往研究^[3]显示，HIV感染中Ⅰ型细胞因子IFN-γ水平出现下降趋势，而Ⅱ型细胞因子IL-4逐渐上升，Thl/Th2细胞平衡向Th2细胞方向漂移。由于Th1细胞有助于增强细胞毒性T细胞应答，而细胞毒性T细胞应答是最重要的抗HIV免疫应答，因此HIV感染中Th1/Th2细胞失衡与AIDS患者病情加重有关^[4]，而长期不进展者则维持正常的Th1/Th2细胞平衡^[5]。迄今为止，HIV感染中Th1/Th2细胞失衡的机制尚未彻底阐明，明确其机制对于HIV临床进程的干预具有重要意义。

T细胞因子1（T cell factor 1，TCF1）是Wnt信号通路的转录因子，结合β-catenin，激活下游信号^[6]。TCF1表达在免疫系统、神经系统疾病及肿瘤发病中具有重要作用^[7-9]。YU等^[10]在对小鼠T淋巴细胞进行研究时发现，TCF1可诱导Th2细胞早期表达，对Th1细胞起到负调控作用。但是，TCF1能否调控HIV感染中Th1/Th2细胞平衡尚无报道。鉴于Th1/Th2细胞漂移在HIV感染致病中的重要作用，本研究探讨了TCF1对HIV感染者Th1/Th2细胞平衡的作用，希望为HIV感染临床结局的免疫调控提供信息。

1 材料与方法 1.1 研究对象

11例HIV感染者均来自辽宁，男性，平均年龄为（40.73±15.60）岁（范围：18~64岁），CD4⁺ T细胞计数绝对值（258.91±63.77）/μL，于抗逆转录病毒治疗前收集血液标本。5例健康对照者为随机选取的HIV抗体阴性的健康成人，男性，平均年龄（31.40±8.43）岁（范围：22~46岁）。研究对象均签署知情同意书。

1.2 siRNA转染

使用Ficoll^®-Paque PLUS（美国GE Healthcare公司）通过密度离心分离HIV感染者CD4⁺、CD8⁺ T细胞的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），将5×10⁵个细胞重悬至160 μL R10培养基（10%胎牛血清，1%青霉素/链霉素，RPMI 1640），制成细胞悬液，接种于96孔板中。每孔加入转染试剂Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent（美国Thermo Fisher Scientific公司）1.2 μL、TCF1-siRNA（北京华大基因公司）0.2 μL、RPMI 1640（美国GE Healthcare公司）38.6 μL，在37 ℃、5%CO₂条件下培养24 h。转染TCF1-siRNA为si-TCF1组，未转染TCF1-siRNA的对照组为TCF1组，Control组为si-TCF1组和TCF1组的画门策略。

1.3 TCF1 mRNA检测

采用RNeasy Micro试剂盒（德国QIAGEN公司）提取HIV感染者CD4⁺、CD8⁺ T细胞的RNA，采用PrimeScript^TM RT reagent试剂盒（日本TaKaRa公司）实时定量PCR方法将RNA逆转录为cDNA。cDNA合成条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，16 ℃终止。利用GAPDH作为内参，配置cDNA实时定量体系，接种于96孔板中。实时定量体系：每孔TCF1/GAPDH-R 0.8 μL、TCF1/GAPDH-F 0.8 μL、无核酸水6.5 μL、cDNA 2 μL、SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ（日本TaKaRa公司）10 μL。实时定量PCR（瑞士Roche公司）检测后对Ct值进行分析。实时定量PCR反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s（扩增40个循环），50 ℃ 30 s。TCF1引物序列：上游引物，5’-CCTTGATGCTAGGTTCTGGTGTACC-3’；下游引物，5’-CACTCTGCAATGACCTTGGCTCTCA-3’。GAPDH引物序列：上游引物，5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’；下游引物，5’-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’。

1.4 细胞培养与流式细胞术

为了检测HIV感染者及健康对照者Th1和Th2细胞因子分泌水平，将HIV感染者及健康对照者新鲜全血经溶血素溶血后每个流式管加入3 μL Cell Activation Cocktail（美国BioLegend公司），在37 ℃、5%CO₂条件下培养4 h，经PBS洗涤离心后进行表面染色与细胞破膜实验，并通过流式细胞仪进行检测。PBMCs转染24 h后，每孔加入1 μL anti-αCD3/CD28 Dynabeads（美国Thermo Fisher Scientific公司）继续培养24 h，在继续培养结束前6 h每孔加入1 μL Golgistop（美国BD公司）。将细胞重悬，使用流式荧光表面抗体Percp-anti-CD3、FITC-anti-CD4、PE（phycoerythrin）-Cy7-anti-CD8进行染色，并置于4 ℃下避光染色30 min。加入LiveDead（美国Life Technologies公司）1 μL，4 ℃避光染色30 min。用FACS缓冲液洗涤2次，加入Cytofix/Cytoperm试剂（美国BD公司）350 μL，4 ℃避光染色40 min。将细胞重悬使用allophycocyanin（APC）-anti-IL-4、BV421-anti-IFN-γ，并置于4 ℃下避光染色30 min。用FACS缓冲液重新悬浮细胞，通过流式细胞仪FaccantoⅡ（美国BD公司）检测后，利用FlowJo软件对数据进行分析。

1.5 统计学分析

采用SPSS19.0软件进行数据处理。采用Mann- Whitney U检验进行组间比较，采用Spearman进行等级相关性分析。P < 0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 7.0绘图软件进行绘图。

2 结果 2.1 HIV感染者及健康对照者Th1和Th2细胞的细胞因子胞内表达

为了测定HIV感染者及健康对照者Th1和Th2细胞因子分泌水平，对CD4⁺ T细胞中Ⅰ型细胞因子IFN-γ和Ⅱ型细胞因子IL-4进行分析。结果发现，HIV感染者CD4⁺ T细胞IFN-γ表达显著低于健康对照者[分别为（3.62±0.87）%和（4.77±0.50）%，P = 0.041，图 1A]；IL-4表达显著高于健康对照者[分别为（8.77±1.37）%和（1.33±0.51）%，P < 0.001，图 1B]。提示HIV感染导致细胞因子从Th1型向Th2型漂移。

2.2 HIV感染者TCF1调节CD4⁺ T细胞的细胞因子胞内表达

HIV感染者敲除TCF1后，CD4⁺ T细胞胞内表达的Ⅰ型细胞因子IFN-γ增加，差异有统计学意义[si-TCF1组（5.03±1.54）%，TCF1组（3.23±1.19）%，P = 0.048，图 2A]；CD4⁺ T细胞胞内表达的Ⅱ型细胞因子IL-4减少，差异有统计学意义[si-TCF1组（4.48±1.66）%，TCF1组（7.58±0.94）%，P = 0.004，图 2B]。提示在敲除了HIV感染者TCF1后，使HIV感染者体内Th2细胞向Th1细胞方向漂移。

2.3 HIV感染者TCF1调节CD8⁺ T细胞的细胞因子胞内表达

TCF1被敲除后，HIV感染者CD8⁺ T细胞胞内表达的Ⅰ型细胞因子IFN-γ增加，差异有统计学意义[si-TCF1组（3.58±0.58）%，TCF1组（1.93±0.43）%，P < 0.001，图 3A]；CD8⁺ T细胞胞内表达的Ⅱ型细胞因子IL-4减少，差异有统计学意义[si-TCF1组（2.40±0.53）%，TCF1组（3.88±1.01）%，P = 0.010，图 3B]。

3 讨论

在人体正常生理条件下，机体Th1/Th2细胞处于动态平衡状态，在病理状态下，这种平衡状态被打破，出现Th1/Th2细胞漂移。有研究^[11]发现，器官特异性自身免疫病以及胞内病原体如结核等，Th细胞亚群向Th1漂移。而系统性自身免疫病、过敏、哮喘及肿瘤等，则出现由Th1向Th2的漂移。以往研究显示，HIV感染中，HIV基因中类过敏原结构可诱导Ⅱ型细胞因子IL-4产生增加，通过上调CXCR4等促进合胞体形成病毒的复制，从而加速疾病进展；而Ⅱ型细胞因子增加，进一步抑制CD4⁺ T细胞向Th1的分化，降低了其对细胞毒性T淋巴细胞的辅助作用，抑制了抗病毒细胞免疫应答，从而加速疾病进展^[12]。本研究还证实，HIV感染后，与健康对照者相比，Ⅰ型细胞因子IFN-γ表达下降，Ⅱ型细胞因子IL-4表达升高，出现Th1向Th2的漂移，如何控制HIV感染中Th细胞亚群的失衡对于疾病进展的控制至关重要。

TCF1对T淋巴细胞的发育具有重要的调控作用，可促进记忆性T细胞的产生^[13]。有学者发现，在TCF1的调控下活化的小鼠CD4⁺ T细胞分化为Th1或Th2细胞，诱导Th2细胞早期表达，对Th1细胞起到负调控的作用^[14]，但在HIV感染中TCF1是否调控Th1/Th2的平衡尚无报道。本研究发现，敲除TCF1后，HIV感染者Th1细胞中的IFN-γ表达增加，Th2细胞中的IL-4表达下降，使得从Th2型向Th1型漂移，提示TCF1有助于纠正HIV感染者Th1/Th2的失衡。此外，研究^[15-16]显示，在一些低CD4⁺ T细胞的HIV感染者中，外周血及皮肤均检出以分泌IL-4等Ⅱ型细胞因子为主的CD8⁺ T细胞，提示CD8⁺ T细胞分泌Ⅱ型细胞因子与疾病进展相关。而CD8⁺ T细胞分泌Ⅰ型细胞因子IFN-γ下降，亦是其功能下降的重要标志。本研究进一步发现，敲除TCF1后，HIV感染者CD8⁺ T细胞中Ⅰ型细胞因子IFN-γ表达增加，Ⅱ型细胞因子IL-4表达下降，提示敲除TCF1亦有助于恢复HIV感染中CD8⁺ T细胞的平衡及功能。

综上所述，本研究首次发现敲除TCF1有助于重建HIV感染中T细胞的免疫平衡及功能，为明确HIV感染的致病机制及免疫干预手段提供重要信息。