2020, Vol. 49文章信息
- 李爽, 张丽艳, 李雪建, 周义, 金戈
- LI Shuang, ZHANG Liyan, LI Xuejian, ZHOU Yi, JIN Ge
- β淀粉样蛋白诱导的阿尔茨海默病小鼠模型中BDNF通过上调TRPC3发挥神经保护作用
- Brain-derived neurotrophic factor plays a neuroprotective role by up-regulating TRPC3 expression in a mouse model of amyloid β-protein-induced Alzheimer disease
- 中国医科大学学报, 2020, 49(12): 1086-1090
- Journal of China Medical University, 2020, 49(12): 1086-1090
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文章历史
- 收稿日期：2019-12-30
- 网络出版时间：2020-12-03 12:17
引用本文 |
2. 沈阳医学院基础医学院药理学教研室, 沈阳 110034
2. Department of Pharmacology, College of Basic Medical Sciences, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, China
阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种以记忆力减退、认知功能障碍以及神经元受损为特征的神经退行性疾病，病理表现为老年斑、神经纤维缠结形成和突触功能障碍等[1]。AD发病机制复杂，在众多假说里，β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)异常沉积占主导地位[2-3]。最近有研究表明，在多种疾病模型中，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)通过参与神经元成熟和突触重塑发挥神经营养作用[4-5]。在APP/PS1双转基因型AD小鼠中，大脑皮层和海马区BDNF的表达量低于野生型小鼠，并伴随着神经元凋亡和空间学习记忆能力减弱[6]。在本课题组的前期研究[7]中，Aβ诱导的AD大鼠模型BDNF表达下降，外源性给予BDNF后认知功能改善。这些数据表明，BDNF在AD模型中发挥神经营养作用，但其作用机制尚不清楚。经典瞬时受体电位通道(canonical transient receptor potential channel，TRPC)家族成员TRPC3在平滑肌、大脑和小脑组织高度表达。有研究[8]报道，在小鼠胚胎干细胞的分化过程中，TRPC3对神经元的存活、多能性和分化方面有重要作用。在癫痫大鼠海马神经元原代培养中，发现BDNF和TRPC3的表达增加，减轻了癫痫引起的细胞损伤和癫痫发作[9]。在心肌梗死大鼠模型中，BDNF/酪氨酸激酶受体B (tyrosine kinase receptor B，TrkB)通过调控TRPC3/6通道，减轻心肌缺血损伤，抑制心肌细胞凋亡[10]。这些数据表明，BDNF可能通过TRPC3通路发挥神经营养作用。本课题组的前期研究[7]表明，在Aβ诱导的AD大鼠模型中，外源性给予BDNF后TRPC3表达增加且认知功能改善，但BDNF与TRPC3的相互关系尚需进一步确定。本研究通过建立AD小鼠模型，内源性激活BDNF，上调、下调TRPC3的表达，观察小鼠的行为学和神经突触功能，明确BDNF是否通过TRPC3改善AD小鼠的认知功能。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物分组和处理80只5周龄雄性费城癌症研究所小鼠(购自辽宁长生生物技术有限公司)，体质量20~24 g，适应性喂养5 d，随机分为对照组、AD组、AD+TrkB受体激动剂7，8-二羟基黄酮(7，8-dihydroxyflavone，7，8-DHF)组(AD+7，8-DHF组)、AD+TRPC3激动剂二酰基甘油类似物(1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol，OAG)组(AD+OAG组)和AD+7，8-DHF+TRPC3抑制剂吡唑化合物(pyrazole compound，Pyr3)组(AD+7，8-DHF+Pyr3组)，每组16只。第6天对照组小鼠给予灭菌生理盐水侧脑室注射，其他4组小鼠给予Aβ1-42侧脑室注射，建立动物模型。待小鼠恢复体力后，AD+7，8-DHF组、AD+OAG组和AD+7，8-DHF+Pyr3组分别给予7，8-DHF (5 mg/kg)、OAG (0.6 mg/kg)、7，8-DHF (5 mg/kg)和Pyr3 (0.1 mg/kg)腹腔注射[11-13]，每日给药1次，连续给药21 d后分离小鼠的海马组织和全脑。TrkB受体激动剂7，8-DHF用于内源性激活BDNF信号传导途径[14]，TRPC3激动剂OAG和TRPC3抑制剂Pyr3分别用于上调和下调TRPC3的表达。
1.1.2 试剂Aβ1-42和钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ-α (calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ-α，CaMKⅡ-α)兔单克隆抗体(英国Abcam公司)；7，8-DHF (大连美伦生物)；OAG和Pyr3 (美国Cayman公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海碧云天公司)；TRPC3兔多克隆抗体(台湾Arigo公司)；synapsin-Ⅰ兔单克隆抗体(美国Cell公司)；β-actin小鼠单克隆抗体和辣根酶标记山羊抗兔IgG (中国Boster生物公司)。
1.2 方法 1.2.1 AD模型制备将Aβ1-42溶于DMSO中，终浓度控制在0.3% (用无菌生理盐水稀释)，然后在37 ℃温箱中孵育120 h。根据小鼠脑立体定位图谱(第2版)确定侧脑室注射位点为前囟后0.5 mm，中线向右旁开1.1 mm。用微量注射器缓慢注射Aβ1-42 3 μL，注射速度为0.6 μL/min，留针5 min。
1.2.2 Morris水迷宫实验Morris水迷宫是评估小鼠空间学习和记忆的经典测试[15]。水迷宫实验(中国上海吉良软件技术有限公司)从造模后第16天开始，持续6 d。圆形水池中装满黑色墨水，平台固定在水池的第三象限，水位在平台上1 cm处，水温保持在(25±1) ℃。水迷宫实验包括定位航行实验(前5 d)和空间探索实验(第6天)，分别测量小鼠的学习和记忆能力。前5 d，将小鼠面对水池壁于不同的象限放入水中，寻找隐藏的平台，每日3次。第6天，将平台移走，观察小鼠在1 min内的动作轨迹。
1.2.3 ELISA使用ELISA试剂盒(台湾Arigo公司)，利用酶标仪测量海马中Aβ1-42的浓度(n = 6)。Aβ1-42浓度(ng/mL) =样品浓度×稀释倍数。
1.2.4 Western blotting海马组织中加入含磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液吹打混匀后进行超声处理，处理完后冰上静置0.5 h，高速离心10 min。取少量上清液，采用BCA法测定蛋白浓度，剩余上清液加蛋白缓冲液进行100 ℃沸水浴变性。取30 μg变性后的蛋白溶液上样于5%SDS-聚丙烯凝胶中，室温下电泳2 h，4 ℃下用转膜仪(中国天能公司)将蛋白转移到硝酸纤维素膜1 h。将膜浸泡在含有5%脱脂牛奶的TBST中，摇床上室温封闭1.5 h，TBST漂洗3次，每次15 min。之后分别与TRPC3小鼠多克隆抗体(1:500)、synapsin-Ⅰ (1:2 000)、CaMKⅡ-α (1:10 000)和β-actin (1:1 500) 4 ℃孵育过夜。第2天，TBST漂洗3次，4 ℃摇床上与辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠IgG (1:5 000)孵育2 h，TBST漂洗3次。最后，用化学发光成像系统(中国天能公司)进行ECL显影并用Image J软件进行条带灰度的定量分析。
1.3 统计学分析采用Graphpad Prism 7.0软件进行统计学处理，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 激活BDNF和TRPC3对AD小鼠空间学习记忆能力的改善作用水迷宫实验结果显示，与对照组小鼠相比，AD组小鼠第5天逃避潜伏期延长(P < 0.001)，第6天目标象限停留时间减少(P < 0.001)，第6天穿越平台次数减少(P < 0.05)，结果表明，AD组小鼠的空间学习记忆能力下降。与AD组小鼠相比，AD+7，8-DHF组和AD+OAG组小鼠第5天逃避潜伏期缩短(P < 0.01)，第6天目标象限停留时间增加(P < 0.01)，第6天穿越平台次数增加(P < 0.05)，结果表明，内源性激活BDNF和上调TRPC3后，AD小鼠空间学习记忆能力得到明显改善。见表 1。
| Group | n | Escape latency (s) | Target quadrant occupancy (s) | Number of platform crossing | ||||
| 1 d | 2 d | 3 d | 4 d | 5 d | ||||
| Control | 6 | 48.27±9.02 | 34.89±9.56 | 33.38±7.48 | 25.21±4.59 | 11.19±2.06 | 26.50±2.70 | 3.67±0.82 |
| AD | 6 | 59.83±0.41 | 53.49±5.21 | 46.41±7.81 | 40.09±8.171) | 36.53±6.571) | 12.47±1.272) | 1.33±1.031) |
| AD+OAG | 6 | 49.68±10.97 | 41.30±4.05 | 34.49±4.18 | 25.94±2.163) | 15.11±1.424) | 21.51±1.364) | 3.17±0.983) |
| AD+7，8-DHF | 6 | 55.81±5.00 | 45.29±9.33 | 35.71±3.90 | 26.66±3.753) | 15.08±2.474) | 20.92±1.524) | 3.33±1.213) |
| AD+7，8-DHF+Pyr3 | 6 | 56.67±5.25 | 49.44±8.76 | 49.76±5.28 | 44.43±1.556) | 33.71±8.287) | 11.09±0.637) | 1.16±0.675) |
| Compared with control group，1) P < 0.01，2) P < 0.001；compared with AD group，3) P < 0.05，4) P < 0.001；compared with AD + 7，8-DHF group，5) P < 0.05，6) P < 0.01，7) P < 0.001. AD，Alzheimer disease；7，8-DHF，7，8-dihydroxyflavone；OAG，1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol；Pyr3，pyrazole compound. | ||||||||
2.2 激活BDNF和TRPC3能够减轻Aβ1-42异常沉积
采用ELISA检测各组海马Aβ1-42浓度，对照组、AD组小鼠、AD+OAG组、AD+7，8-DHF组和AD+7，8-DHF+Pyr3组小鼠Aβ1-42浓度分别为(271.1±34.03)、(837.9±66.09)、(523.6±79.29)、(458.7±59.37)、(954.8±23.19) pg/mL。与对照组相比，AD组小鼠Aβ1-42浓度增高(P < 0.001)；与AD组小鼠相比，AD+7，8-DHF组和AD+OAG组小鼠Aβ1-42浓度降低(均P < 0.01)。结果表明，激活BDNF和TRPC3减轻了Aβ1-42的异常沉积。
2.3 激活BDNF和TRPC3促进突触相关蛋白synapsin-Ⅰ和CaMKⅡ-α的表达Western blotting结果显示，与对照组小鼠相比，AD组小鼠TRPC3、突触相关蛋白(synapsin-Ⅰ、CaMKⅡ-α)表达均降低(分别为P < 0.01，P < 0.001，P < 0.001)，表明AD组小鼠神经突触功能受损。与AD组小鼠相比，AD+7，8-DHF组和AD+OAG组小鼠TRPC3、突触相关蛋白(synapsin-Ⅰ、CaMKⅡ-α)表达均增加(分别为P < 0.01，P < 0.001，P < 0.01)，表明激活BDNF和TRPC3明显改善神经突触功能。见图 1、表 2。
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| A, TRPC3 protein expression; B, synapsin-Ⅰ protein expression; C, CaMKⅡ-α protein expression. 1, control group; 2, AD group; 3, AD+7, 8-DHF group; 4, AD+OAG group; 5, AD+7, 8-DHF+Pyr3 group. 图 1 Western blotting检测各组小鼠海马区TRPC3、synapsin-Ⅰ和CaMKⅡ-α蛋白表达 Fig.1 Expression of TRPC3, synapsin-Ⅰ, and CaMKⅡ-α proteins in the hippocampus of mice in each group detected using Western blotting |
| Protein | Control group (n = 5) | AD group (n = 5) | AD+OAG group (n = 5) | AD+7，8-DHF group (n = 5) | AD+7，8-DHF+Pyr3 group (n = 5) |
| TRPC3 | 1.05±0.16 | 0.51±0.161) | 1.06±0.283) | 0.96±0.173) | 0.56±0.125) |
| Synapsin-Ⅰ | 0.78±0.09 | 0.12±0.022) | 0.58±0.064) | 0.47±0.054) | 0.30±0.076) |
| CaMKⅡ-α | 0.76±0.08 | 0.27±0.032) | 0.67±0.033) | 0.57±0.063) | 0.38±0.105) |
| Compared with control group，1) P < 0.01，2) P < 0.001；compared with AD group，3) P < 0.01，4) P < 0.001；compared with AD + 7，8-DHF group，5) P < 0.05，6) P < 0.01. | |||||
2.4 BDNF通过上调TRPC3减轻Aβ沉积进而改善AD小鼠的认知和神经突触功能
水迷宫实验结果显示，与AD+7，8-DHF组小鼠相比，AD+7，8-DHF+Pyr3组小鼠第5天逃避潜伏期延长(P < 0.001)，第6天目标象限停留时间减少(P < 0.01)，第6天穿越平台次数减少(P < 0.05)，结果表明，抑制TRPC3表达降低了BDNF对AD小鼠认知功能的改善作用。见表 1。
ELISA结果显示，与AD+7，8-DHF组小鼠相比，AD+7，8-DHF+Pyr3组小鼠Aβ1-42浓度显著降低(P < 0.001)，结果表明，抑制TRPC3表达降低了BDNF对AD小鼠中Aβ1-42沉积的清除作用。
Western blotting结果显示，与AD+7，8-DHF组小鼠相比，AD+7，8-DHF+Pyr3组小鼠TRPC3、synapsin-Ⅰ和CaMKⅡ-α蛋白表达均降低(分别为P < 0.05，P < 0.01，P < 0.05)，结果表明，抑制TRPC3表达降低了BDNF对AD小鼠神经突触功能改善作用。见表 2。
以上结果表明，BDNF通过上调TRPC3的表达减轻了Aβ异常沉积，进而改善AD小鼠的认知和神经突触功能。
3 讨论已有研究[16-17]报道，BDNF在AD模型中表达下降，上调BDNF后AD模型认知和神经突触功能得到改善，但TRPC3对AD的认知和神经突触功能的作用未见报道。本课题组的前期研究[7]发现，AD大鼠中BDNF和TRPC3蛋白表达降低，侧脑室注射BDNF后TRPC3表达增加，认知功能得到改善。本研究中，AD小鼠TRPC3表达降低，给予7，8-DHF (内源性激活BDNF)后TRPC3表达增加，与之前的研究结果一致。给予OAG (激活TRPC3)后TRPC3表达增加，AD小鼠认知和神经突触功能改善，说明TRPC3具有改善AD小鼠认知和神经突触功能的作用。另外，上调BDNF后AD小鼠的认知和神经突触功能得到改善，但抑制TRPC3通道后再上调BDNF，AD小鼠认知和神经突触功能并未得到改善，说明BDNF通过上调TRPC3的表达来发挥神经保护作用。
Aβ是由β淀粉样蛋白前体蛋白水解而成，其在脑内异常沉积形成老年斑。老年斑是AD的主要病理变化，也是神经元死亡的关键因素[18]。本研究中，上调BDNF和TRPC3均使AD小鼠Aβ沉积减轻，而使用TRPC3抑制剂上调BDNF并没有减轻Aβ沉积，说明BDNF可能通过TRPC3清除Aβ沉积，从而达到神经保护作用。但TRPC3通过何种途径清除Aβ沉积，具体机制并不清楚。目前，Aβ主要通过血脑屏障和脑血管周隙-淋巴2种途径进行清除[19-20]。但有研究[21]报道，缺氧模型中TRPC通过钙离子内流导致血脑屏障受损。因此，TRPC3是否影响血脑屏障以及是否通过血脑屏障清除Aβ沉积，尚需进一步研究证明。
已有研究报道，在急性心肌梗死大鼠模型中BDNF/TrkB通过TRPC3通道抑制缺血引起的心肌细胞凋亡[10]。嗅鞘细胞的迁移对神经再生和嗅觉发育至关重要。WANG等[22]发现BDNF通过TRPC3促进嗅鞘细胞的迁移。然而，ARAVAMUDAN等[23]认为，TRPC3/6正向调控BDNF的释放，在哮喘患者气道平滑肌细胞中，以RNA干扰技术检测到TRPC3/6通过调控BDNF的分泌来调节气道平滑肌的变化。这些证据说明，BDNF和TRPC3具有协同作用，但具体机制有待进一步探讨。
综上所述，本研究表明，BDNF/TrkB通过调节AD小鼠海马中TRPC3的表达，减轻Aβ的沉积，从而发挥其对AD小鼠认知功能和突触功能障碍的改善作用。BDNF和TRPC3激动剂可能成为AD治疗的候选药物。
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