我国将3次及3次以上在妊娠28周之前的胎儿丢失称为复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)，但《复发性流产专家共识》^[1]中指出连续发生2次流产即应重视并予评估，因其再次出现流产的风险与3次者相近。RSA病因复杂，约半数患者存在免疫功能紊乱，自然杀伤(natural killer，NK)细胞数量、功能及表面受体的表达被认为与RSA的发生密切相关^[2-3]。NKG2C作为NK细胞的活化性受体，激活后可引起细胞杀伤能力升高，从而对肿瘤细胞及感染起抑制作用^[4-5]，目前尚未见其在RSA中的研究。本研究拟通过流式细胞术检测RSA患者外周血NK及NKG2C⁺NK细胞百分比变化，探讨NK细胞及其受体NKG2C与RSA的相关性，为RSA的免疫学机制研究提供思路。

1 材料与方法 1.1 研究对象

选择2018年9月至2019年11月就诊于中国医科大学附属盛京医院产科门诊的早孕期RSA患者(57例)及孕6~12周正常孕妇(30例，正常对照组)。将RSA患者根据此次妊娠胚胎是否丢失分为RSA流产组(15例)与RSA妊娠组(42例)。RSA流产组年龄24~41岁，体质量指数20.83~30.30 kg/m²，流产时孕6~12周；RSA妊娠组年龄22~43岁，体质量指数16.02~30.11 kg/m²；对照组年龄22~41岁，体质量指数17.81~31.25 kg/m²。3组年龄、体质量指数、孕周均无统计学差异，具有可比性，见表 1。

RSA组纳入标准为与同一性伴侣于20周前连续发生≥2次的自然流产，排除双方存在染色体数目或结构异常可能导致的流产，排除女方存在生殖器官解剖异常及生殖道炎症，排除慢性高血压、心脏病、内分泌异常、自身免疫性疾病、病毒感染等因素引起的流产；正常对照组纳入标准为既往无自然流产史及异常生育史，此次妊娠无异常阴道流血，超声提示正常宫内妊娠，可探及妊娠囊及胎心，胎芽与孕周相符，未见宫腔积液，既往健康无任何基础疾病。3组患者均于早孕期门诊就诊时抽取肘静脉血。本研究已获得研究对象知情同意，并获得中国医科大学附属盛盛京医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 仪器与试剂

FACS Calibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；PerCP/Cy5.5-CD3 (批号317336，美国Biolegend公司)；FITC-CD56 (批号562794，美国BD公司)；PE-CY7-CD16 (批号557744，美国BD公司)；APC-NKG2C (批号FAB138A，美国R & D公司)；溶血素(批号5154719，美国BD公司)。

1.2.2 流式细胞术

用EDTA抗凝管采集研究对象外周血，暂存于4 ℃待检。在流式管中加入混合单克隆荧光抗体(包括PerCP-Cy5.5-CD3抗体、FITC-CD56抗体、PE-CY7-CD16抗体、APC-NKG2C抗体)，吸取抗凝管内外周血100 µL加入流式管振荡混匀，避光孵育15 min后，加入1 mL红细胞裂解液，振荡混匀裂解10 min，PBS洗涤2次，加入300 µL PBS溶液重悬震荡，采用FACS Calibur流式细胞仪检测。用流式数据分析软件flowjo-v10分析外周血流式数据，结果以阳性率(%)表示。本研究用CD3、CD56、CD16进行外周血NK细胞的圈门实验，首先根据前向角、侧向角来确定淋巴细胞区域，再根据CD3^-CD56⁺确定NK细胞大致区域，根据CD56表达强弱及CD16分为CD56^brightCD16^-及CD56^dimCD16⁺亚群，见图 1。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，计量资料用x±s表示。符合正态分布数据的2组间比较采用t检验，3组间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布数据2组间比较采用秩和检验，3组间比较采用Kruskal-Wallis分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

RSA流产组总NK细胞百分比显著高于RSA妊娠组及正常对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)；RSA流产组NK细胞CD56^dimCD16⁺亚群虽高于RSA妊娠组及正常对照组，但差异无统计学意义(P > 0.05)；RSA流产组NK细胞CD56^brightCD16^-亚群低于RSA妊娠组及正常对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)；RSA流产组NKG2C⁺NK细胞百分比较RSA妊娠组及正常对照组显著增高，差异有统计学意义(P < 0.05)，见表 2。

3 讨论

NK细胞是人体的固有免疫细胞，在机体遇到外来刺激时无需抗原刺激即可发挥免疫作用^[6]。人类NK细胞根据表面标志可分为CD56^dimCD16⁺及CD56^brightCD16^-亚群^[7]，外周血中约90%的NK细胞为CD56^dimCD16⁺表型，行使免疫监视与免疫杀伤作用，而仅有不足10%的NK细胞为CD56^brightCD16^-表型，通过分泌细胞因子行使免疫营养与免疫保护作用。目前，国内外关于外周血NK细胞数量改变与RSA之间联系的相关研究结果具有较大争议，大部分研究^[8-9]发现RSA患者总NK细胞数量较正常孕妇高，但也有研究认为NK细胞在RSA中的作用主要体现在细胞功能上，而不是体现在细胞总数上。目前关于NK细胞亚群CD56^dimCD16⁺、CD56^brightCD16^-与RSA之间关系的研究较少。本研究发现，RSA流产患者外周血总NK细胞数量明显高于RSA妊娠患者(P < 0.05)，与正常早孕期孕妇相比，虽然数值较高但无统计学差异，而RSA妊娠患者外周血总NK细胞数量与正常早孕期孕妇相比稍低(P > 0.05)。KING等^[8]也发现RSA流产患者外周血总NK细胞数量高于正常妊娠组，与本研究结果一致。本研究还发现，RSA患者若此次早孕期未发生自然流产，其外周血NK细胞数量将保持较低水平，甚至略低于正常早孕期孕妇。说明RSA患者自然流产的发生与NK细胞数量增加关系密切，通过改变NK细胞的数量，也许能够避免NK细胞增多型RSA患者继续发生自然流产事件。本研究还对NK细胞CD56^dimCD16⁺及CD56^brightCD16^-细胞亚群进行了比较，发现RSA流产患者外周血CD56^dimCD16⁺NK细胞比例高于RSA妊娠患者及正常早孕期孕妇，但差异无统计学意义。CD56^dimCD16⁺NK细胞在外周血中发挥细胞杀伤毒性作用，其比例增高说明外周血NK细胞杀伤功能是RSA患者发生自然流产的重要因素，KARAMI等^[10]也发现CD56^dimNK细胞比例在RSA及人工授精失败患者中增高，与本研究结果一致。但由于本研究中纳入的RSA流产患者较少，故未能发现显著的统计学差异。本研究还发现，RSA妊娠患者外周血CD56^brightCD16^-NK细胞比例明显高于正常早孕期孕妇。CD56^brightCD16^-NK细胞约占外周血NK细胞的不足10%，主要分布在蜕膜组织中，占蜕膜NK细胞的70%左右。研究^[11]发现，蜕膜CD56^brightCD16^-NK细胞可分泌大量细胞因子，促进滋养细胞侵袭及血管重塑，对成功妊娠发挥积极作用。本研究证实了外周血中CD56^brightCD16^-NK细胞对RSA患者成功妊娠的积极作用。PARK等^[7]认为外周血NK细胞能反映蜕膜NK细胞水平的变化，是预测妊娠结局的有效指标，但外周血CD56^brightCD16^-NK细胞增多是否会促进蜕膜CD56^brightCD16^-NK细胞的募集目前仅是一种猜测，需要进一步研究。本研究中，为了更深入探讨NK细胞受体与RSA的相关性，对NK细胞的活化性受体NKG2C进行了比较分析，结果发现RSA流产患者NKG2C⁺NK细胞比例显著高于RSA妊娠患者与正常早孕期孕妇(P < 0.05)，提示外周血中NKG2C⁺NK对成功妊娠是不利因素。目前国内外关于NKG2C⁺NK与妊娠关系的研究较少，罗方媛等^[12]研究发现重度子痫前期患者蜕膜NK细胞激活性受体NKG2C⁺NK的表达水平增加，推测其表达增高可能导致NK细胞杀伤能力增强，从而影响滋养细胞的浸润能力，导致子痫前期的发病。RSA与子痫前期的发病机制相似，在RSA患者外周血中发现了相同的表达趋势，需进一步探究其具体作用机制。

综上所述，本研究结果提示，RSA患者外周血NK细胞百分比变化及NKG2C⁺NK细胞增多可能导致免疫平衡失调，引起自然流产，对于NK细胞数量较高的RSA患者可以尝试针对性的免疫治疗方案。本研究还存在一定的局限性，有待进一步扩大样本量进行比较分析。