喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，其中96%~98%为喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）^[1]。根据国际癌症研究署最新发布的GLOBOCAN 2018统计资料显示，2018年全球约有17.7万喉癌新发病例，占所有癌症新发病例的1.0%^[2]。国家癌症中心数据显示，2015年我国新增喉癌患者约2.64万，喉癌死亡患者约1.45万^[3]。在我国，东北和华北地区喉癌发病率相对较高，尤其是东北地区，近年来发病率呈增高趋势^[4]。而喉癌患者总体预后仍不理想，其晚期生存率仅为44%^[5]。因此，寻求新的喉癌相关治疗靶点是早期预防、诊断和制定个体化治疗策略的关键。Nin-one结合蛋白（Nin-one binding protein，NOB1）是一种RNA结合蛋白，在核糖体合成、调节细胞周期和RNA代谢中有重要作用^[6-9]。研究^[10-15]表明，NOB1的异常表达往往会导致细胞恶性增殖。本研究采用免疫组化SP法检测LSCC中NOB1蛋白的表达情况及其与临床病理参数的相关性，探讨其作为LSCC早期诊断和新的预后标志物的可能性。

1 材料与方法 1.1 标本收集和患者随访

收集2009年6月至2016年12月中国医科大学附属盛京医院耳鼻喉科收治的226例LSCC患者的手术标本。所有患者术后病理诊断均为LSCC，且病历资料完整，术前均未经过放化疗。同时收集患者癌旁组织，将45例经HE染色证实的正常黏膜作为对照。226例LSCC患者中，男159例，女67例，平均年龄（60.52±8.41）岁（42~79岁）；临床分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期66例，Ⅲ期71例，Ⅳ期62例；临床分型：声门上型107例，声门型91例，声门下型28例；组织分化程度：低分化26例，中分化104例，高分化96例。生存时间从手术日开始至随访日期或者截至由于喉癌复发及其他因素导致患者死亡的日期，按月计算。全部患者随访至2019年5月，随访时间18~118个月，中位随访时间59个月。

1.2 主要试剂

NOB1多克隆抗体（工作浓度1:200，英国Abcam公司）；SP免疫组化染色试剂盒和DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 方法

所有标本均用4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水，石蜡包埋，3.5 μm连续切片，于70 ℃烤片2 h后，常规脱蜡水化。置于pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液抗原修复液中，热修复10 min，冷却至室温，然后按SP试剂盒说明进行实验。于显微镜下DAB染色，蒸馏水终止反应。后经苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明，最后中性树胶封片。使用PBS溶液取代一抗作为阴性对照，排除非特异性染色。

1.4 结果评估

采用双盲法对染色结果进行评估，免疫组化染色阳性结果为细胞质和（或）细胞核出现淡黄色或棕黄色、棕褐色。每张切片选择5个有代表性高倍视野（×200）。根据阳性细胞所占百分比和阳性细胞染色强度，用半定量免疫评分法来判定实验结果。阳性细胞所占百分比：≤10%，0分；> 10%~25%，1分；> 25%~50%，2分；> 50%~75%，3分；> 75%，4分。染色强度：不染色，0分；淡黄色，1分；棕黄色，2分；黄褐色，3分。阳性细胞所占百分比与染色强度相加，0~3分为阴性，> 3分为阳性。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0软件对数据进行分析。计数资料应用行×列联表的χ²检验，采用Spearman秩相关分析进行相关性分析。采用Kaplan-Meier法统计患者生存率，采用log-rank法进行生存率差异性分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 NOB1蛋白在LSCC组织和癌旁正常黏膜组织中的表达

免疫组化染色（图 1）显示，226例LSCC组织中NOB1主要在细胞质中呈弥漫性表达，少数细胞核中也有表达，呈现淡黄色、棕黄色或棕褐色，NOB1阳性表达142例，NOB1阳性表达率为62.8%；45例癌旁正常黏膜组织中NOB1阳性表达6例，NOB1阳性表达率为13.3%。LSCC组织中NOB1的阳性表达率明显高于癌旁正常黏膜组织，差异有统计学意义（χ²=37.094，P < 0.01）。

2.2 LSCC患者中NOB1蛋白表达与临床病理特征的关系

伴有颈部淋巴结转移的LSCC患者中NOB1阳性表达率为94.7%，无淋巴结转移的LSCC患者中NOB1阳性表达率为39.7%，差异有统计学意义（χ²=71.438，P < 0.05）。晚期（Ⅲ~Ⅳ期）LSCC患者中NOB1阳性表达率为76.7%，而早期（Ⅰ~Ⅱ期）LSCC患者中NOB1阳性表达率为43.0%，差异有统计学意义（χ²=26.585，P < 0.05）。NOB1蛋白表达与LSCC患者的年龄、性别、组织分化程度、肿瘤发生部位无关（P > 0.05）。见表 1。

2.3 NOB1蛋白表达与LSCC患者预后的关系

226例LSCC患者中NOB1蛋白阳性表达142例，阴性表达84例。采用Kaplan-Meier法对LSCC患者进行生存分析（图 2），结果发现，NOB1阳性表达组5年生存率为54.4%，NOB1阴性表达组5年生存率为89.8%。采用log-rank法比较2组的生存率，结果显示生存率有统计学差异（χ²=31.277，P < 0.05）。

3 讨论

NOB1是酵母基因Nob1p的人类同源体，是一种进化保守的蛋白质，含有2个RNA结构域（N端的PIN结构域和C端的锌指结构域）^[6]，能促进20S蛋白酶体成熟，参与26S蛋白酶体的形成与降解，相当于26S蛋白酶体的亚基，对18S rRNA成熟起关键作用^[7-8]，参与了核糖体40S小亚基的合成^{[7, 9]}。NOB1的异常表达影响蛋白酶体和核糖体的正常合成，造成体内泛素-蛋白酶体途径异常，从而导致蛋白质降解异常。正常情况下，NOB1蛋白主要在人肺、脾脏和肝脏中表达，同时在食管、肾、结肠、肝、甲状腺、卵巢等组织中有少量表达^[10]。目前一些基础研究表明，NOB1在肿瘤细胞的恶性增殖中发挥重要作用^[11]，其在胃癌^[12]、骨肉瘤^[13]、甲状腺乳头状癌^[14]、前列腺癌^[15]、口腔鳞癌^[16]等肿瘤组织中的表达均高于正常组织。

本研究发现，与癌旁正常喉黏膜相比，NOB1蛋白在LSCC组织中的表达明显升高，并与淋巴结转移、临床分期相关。已有研究表明，在多种肿瘤组织中NOB1蛋白表达增加，这与本研究发现的NOB1蛋白在LSCC中表达增加的趋势一致。本研究表明，NOB1的异常表达可能与喉癌颈部淋巴结转移过程相关。本课题组前期研究^[17]发现，沉默NOB1可抑制喉癌Hep-2细胞增殖，抑制细胞周期进程，诱导细胞凋亡，抑制喉癌细胞的迁移和侵袭。本研究发现，喉癌组织标本中NOB1蛋白表达与淋巴结转移和临床分期相关。以上研究表明，NOB1可能在LSCC的发生、增殖、侵袭和转移中有重要的作用。NOB1蛋白高表达提示喉癌预后不良，可作为潜在的评估喉癌患者预后的标志物。