2020, Vol. 49文章信息
- 王丽纳, 王红兰, 庄永灿, 王凯波, 陈文标
- WANG Lina, WANG Honglan, ZHUANG Yongcan, WANG Kaibo, CHEN Wenbiao
- miR-146a对人黑色素瘤A375细胞增殖和侵袭的影响及作用机制
- Effect and mechanism of miR-146a on proliferation and invasion of human melanoma A375 cells
- 中国医科大学学报, 2020, 49(10): 907-910
- Journal of China Medical University, 2020, 49(10): 907-910
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文章历史
- 收稿日期：2019-10-18
- 网络出版时间：2020-10-07 16:13
引用本文 |
2. 沈阳市第七人民医院皮肤科, 沈阳 110003;
3. 泉州医学高等专科学校病原微生物与免疫学教研室, 福建 泉州 362000
2. Department of Dermatology, the Seventh People's Hospital of Shenyang, Shenyang 110003, China;
3. Department of Pathogenic Microorganism and Immunology, Quanzhou Medical College, Quanzhou 362000, China
黑色素瘤起源于黑色素细胞，多发生于皮肤，易侵袭、转移，并且难以治愈，是皮肤癌中最具侵袭性的肿瘤。虽然黑色素瘤仅占皮肤癌的4%，但死亡人数约占所有皮肤癌死亡人数的75%[1-2]。微小RNA (microRNA，miRNA)是细胞内的一类小分子RNA，核苷酸片段长度17~25，主要功能是调控多种基因转录，通过抑制蛋白的表达继而调控细胞的增殖、凋亡等生命活动[3-4]。越来越多的研究[5-6]发现，黑色素瘤中存在着多种miRNA表达异常，miRNA可能在黑色素瘤进展过程中发挥着重要的作用。miRNA-146a (miR-146a)作为miR-146家族中的一员，已被证实是很强的促凋亡因子，参与了多种肿瘤增殖、迁移和侵袭的生物学过程[7-8]。研究[9]发现，miR-146a通过下调NUMB蛋白，激活Notch信号参与黑色素瘤的发生发展。本研究通过将miR-146a模拟物或抑制剂转染入黑色素瘤A375细胞，使miR-146a过表达或低表达，检测miR-146a对黑色素瘤细胞A375增殖侵袭能力及对FBXL10蛋白表达的影响，旨在阐明miR-146a在黑色素瘤发生发展中的作用机制。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器皮肤黑色素瘤细胞系A375购于中国科学院上海细胞库；FBXL10抗体购自美国Cell signalling公司；FBXL10 mRNA由大连宝生物有限公司设计并合成；miR-146a模拟物、抑制剂及阴性对照均由上海吉玛公司设计合成；DMEM培养基、PRMI 1640培养基与胎牛血清购于美国Gibco公司；转染试剂与TRIzol购自美国Invitrogen公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞转染及分组收集A375细胞，胰酶消化，重悬制备成细胞悬液并计数，以3.0×105/孔接种于6孔板，细胞生长达到70%~80%时开始转染，步骤按照说明书进行操作。按照转染物将细胞分为miR-146a模拟物组、miR-146a抑制剂组及阴性对照组，转染48 h后进行转染效率检测。
1.2.2 MTT实验收集转染后的各组细胞接种于96孔板，密度为1×104/孔，利用MTT检测试剂盒检测细胞增殖情况，操作按说明书进行，吸光度值利用酶标仪检测，波长490 nm，单纯加DMSO试剂的孔作为内参对照。
1.2.3 Transwell侵袭实验将转染后的各组细胞重悬，并将浓度调整为2×105/mL，小室中聚碳酸酯膜的孔径为8 µm，在上室内加入100 μL细胞悬液，下室内加入600 μL完全培养基，孵育24 h，然后以无水甲醇固定，再用棉签擦去上室内的胶与细胞后，结晶紫染色，镜下拍照计数，计算穿膜细胞平均值。
1.2.4 生物信息学预测与荧光素酶报告分析根据TargetScan (http://www.targetscan.org)、MiRDB (http://mirdb.org/miRDB/)、PITA (http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html)对miR-146a潜在的靶点进行预测，选择FBXL10为其下游靶基因。根据FBXL10的3’UTR序列设计引物，扩增后将其克隆到双荧光素酶报告载体中，转染293T细胞，通过荧光素酶活性变化观察miR-146a对FBXL10表达的影响。
1.2.5 实时qPCR实验收集各组细胞，提取各组细胞的总RNA，测定纯度及浓度后逆转录合成cDNA，再以其为模板进行PCR扩增，反应条件为95 ℃，3 min；95 ℃，30s，62 ℃，40s，40个循环。以U6作为内参照，用2-ΔΔCt法来计算结果。
1.2.6 Western blotting检测在转染48 h后，收集A375细胞，超声波破碎，离心后收集上清，以BCA试剂盒进行蛋白定量，每孔的蛋白上样量30 μg，SDS电泳，转印，BSA封闭过夜，次日取出后TTBS漂洗，一抗、二抗均于摇床上室温孵育2 h，TTBS漂洗，ECL发光，扫描电泳条带进行光密度值分析。
1.3 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行分析，数据用x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 转染效率检测结果结果显示，miR-146a模拟物组、miR-146a抑制剂组、阴性对照组、未处理组miR-146a表达分别为2.26±0.31，0.51±0.06，1.02±0.06，1.00±0.05。miR-146a模拟物组miR-146a表达显著高于阴性对照组(P < 0.01)；miR-146a抑制剂组miR-146a表达显著低于阴性对照组(P < 0.01)，提示miR-146a模拟物与miR-146a抑制剂转染成功。
2.2 MTT检测结果结果显示，miR-146a模拟物组、miR-146a抑制剂组、阴性对照组、未处理组490 nm的光密度(optied density，OD)值分别为0.65±0.07，1.58±0.16，1.12±0.13，1.06±0.11。与阴性对照组比较，miR-146a模拟物组490 nm的OD值显著降低(P < 0.01)；miR-146a抑制剂组490 nm的OD值显著升高(P < 0.01)。而未处理组与阴性对照组比较无统计学差异(P > 0.05)。提示miR-146a模拟物能够降低A375细胞的增殖能力，miR-146a抑制剂能够增强A375细胞的增殖能力。
2.3 Transwell侵袭实验结果结果显示，与阴性对照组穿膜细胞数(65.8土6.9)比较，miR-146a模拟物组A375细胞的穿膜数(46.2土5.1)显著降低(P < 0.01)；miR-146a抑制剂组A375细胞的穿膜数(89.7土8.5)显著升高(P < 0.01)。提示miR-146a模拟物能够降低A375细胞的侵袭能力，miR-146a抑制剂能够增强A375细胞的侵袭能力，见图 1。
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| A, untreated group; B, miR-146a mimics group; C, miR-146a inhibitor group. 图 1 miR-146a模拟物和miR-146a抑制剂对A375细胞侵袭能力的影响×200 Fig.1 Effects of miR-146a mimics or inhibitors on the invasive ability of A375 cells ×200 |
2.4 荧光素酶报告分析结果
利用荧光素酶报告系统分析miR-146a对FBXL10表达的影响，结果发现，阴性对照组、miR-146a模拟物+突变组、miR-146a模拟物+野生型组、miR-146a阴性对照+突变组、miR-146a阴性对照+野生型组的相对光素酶活性值分别为1.00±0.00，0.96±0.11，0.48±0.06，0.99±0.11，1.02±0.12。与阴性对照组比较，miR-146a模拟物+突变组荧光素酶活性无统计学差异(P > 0.05)，而miR-146a模拟物+野生型组荧光素酶活性显著降低(P < 0.01)，提示FBXL10为miR-146a的下游靶点。
2.5 实时qPCR检测结果结果显示，与阴性对照组(7.22土0.75)比较，miR-146a模拟物组(4.85±0.52) A375细胞FBXL10 mRNA表达显著降低(P < 0.01)；miR-146a抑制剂组(11.29±1.26) A375细胞FBXL10 mRNA表达显著升高(P < 0.01)。
2.6 Western blotting检测结果与阴性对照组(0.42土0.05)比较，miR-146a模拟物组(0.21±0.02) A375细胞FBXL10蛋白表达显著降低(P < 0.01)；miR-146a抑制剂组(0.69±0.07) A375细胞FBXL10蛋白表达显著升高(P < 0.01)，见图 2。
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| 1, untreated group; 2, miR-146a inhibitor group; 3, miR-146a mimics group. 图 2 Western blotting检测FBXL10的表达结果 Fig.2 FBXL10 expression by western blotting |
3 讨论
皮肤黑色素瘤是恶性黑色素细胞在皮肤上形成的异质性肿瘤，发病率在西方国家呈现递增趋势，患病率每年以3%~8%的速度递增，手术切除、化疗、免疫治疗、放射治疗等是目前临床上常见的治疗手段，但治疗效果均不理想[10]。因此，阐明皮肤黑色素瘤的发病机制具有重要意义。
miRNA是一种内源性非编码的单链RNA，具有序列特异性，能够调控肿瘤细胞的增殖、分化、转移和凋亡等生命过程[11]。研究[12-14]发现，甲状腺癌和前列腺癌组织中miR-146a表达水平显著降低。miR-146a具有抑制肿瘤细胞增殖、分化、侵袭等功能，可能扮演抑癌基因的作用，但是miR-146a对黑色素瘤细胞A375增殖能力的影响尚未见研究报道。
为了阐明miR-146a对黑色素瘤细胞A375增殖能力的影响，本研究分别用miR-146a模拟物过表达或抑制剂抑制黑色素瘤A375细胞中miR-146a的表达，然后利用MTT方法检测黑色素瘤细胞A375增殖能力。结果发现下调miR-146a的表达能够显著增强黑色素瘤A375细胞的增殖能力，而过表达miR-146a则得到相反结果。随后又通过Transwell侵袭实验验证miR-146a对黑色素瘤A375细胞侵袭能力的影响。结果发现下调miR-146a的表达能够显著增强A375细胞的侵袭能力，过表达miR-146a则得到相反的结果。但是，miR-146a沉默能够显著增强A375细胞增殖和侵袭能力的机制仍需进一步研究。
FBXL10是组蛋白赖氨酸去甲基化酶亚家族JmjC蛋白家族的成员之一，是组蛋白H3赖氨酸36 (H3K36)去甲基化酶，是重要的细胞周期调控因子，是正常细胞生长发育的关键因素，对细胞增殖、衰老、肿瘤发生、细胞死亡发挥着关键的调控作用[15-17]。在黑色素瘤中，miR-146a是否能够调节FBXL10的表达尚未见研究报道。为了明确FBXL10是否为miR-146a调控A375细胞增殖和侵袭信号通路的下游靶基因，在下调miR-146a表达或过表达miR-146a后，本研究采用实时qPCR与Western blotting检测黑色素瘤A375细胞FBXL10 mRNA与蛋白的表达。结果发现过表达miR-146a后，黑色素瘤A375细胞中FBXL10 mRNA与蛋白表达均显著降低，而在抑制miR-146a表达后，黑色素瘤A375细胞FBXL10 mRNA与蛋白表达均显著升高。因此认为调节FBXL10表达可能是miR-146a调控A375细胞增殖侵袭能力的作用机制之一。
综上所述，miR-146a过表达能够明显抑制A375细胞的增殖，同时抑制其侵袭能力，其作用机制可能与FBXL10活性被抑制有关，进而调节下游靶蛋白表达，发挥抗肿瘤作用。本研究为黑色素瘤的临床治疗提供了一定的理论依据。
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