卵巢癌的发病率居妇科恶性肿瘤第3位，病死率居首位。卵巢癌起病隐匿，缺乏早期的典型症状和成熟的早期诊断方法，且易于盆腹腔广泛种植播散，80%~85%患者还会出现复发和转移，5年生存率仅为35%~38%^[1]。因此，提高对卵巢癌发生过程中基因表达变化的认识，识别新的癌症诊断生物标志物和新的治疗靶点，明确相关分子机制，可能有助于提高诊断、治疗和预防水平。再生基因(regenerating gene，REG)家族属于钙依赖性凝集素超家族，这些蛋白在功能上类似于凝集素，具有抗凋亡因子作用，REG基因编码分泌蛋白，在糖尿病、炎症损伤自身免疫和癌瘤发生中起重要作用^[2]。随着对癌症发生、发展及其机制研究的不断深入，已有文献报道再生基因4(regenerating gene family member 4，REG4)在肿瘤细胞中高表达，对肿瘤的发展、治疗和预后产生重要影响，但关于卵巢癌中REG4的表达及其分子机制少见报道。本研究旨在观察REG4在卵巢癌中的作用及其分子机制。

1 材料与方法 1.1 材料

pcDNA3.1-REG4表达质粒由日本东北大学再生先进生物科学系SUGAWARA教授提供；卵巢癌SKOV3细胞系购自美国ATCC公司；细胞培养试剂购自美国Gibco公司；细胞转染试剂、RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；实时PCR、SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ、反转录酶、随机引物购自日本TaKaRa公司；REG4抗体购自美国R & D公司；FITC/PI试剂盒购自中国凯基公司；Transwell小室购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 基因表达分析

UCSC Xena数据库集合了包括癌症基因组图谱(The cancer genome atlas，TCGA)、国际肿瘤基因组协作组(International Cancer Genome Consortium，ICGC)、基因型-组织表达数据库(Genotype-Tissue Expression，GTEx)、癌细胞系百科全书(Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE)等在内大约200个公共数据集，进入UCSC Xena (http://xena.ucsc.edu)网页调取TCGA、TARGET、GTEx数据库，选择sample type和ovary，输入REG4，选择Gene Expression，对REG4在卵巢的mRNA表达进行分析。调取TCGA数据库，选择sample type和ovary，再选择REG4和感兴趣的基因，分析REG4与该基因在mRNA表达水平上的关系。

1.2.2 生存分析

使用Kaplan-Meier Plotter (http://www.kmplot.com)评估REG4 mRNA表达对卵巢癌预后的影响。Kaplan-Meier Plotter分析各亚型卵巢癌患者的总体生存率、无进展生存率和后进展生存率与REG4 mRNA表达的关系。

1.2.3 细胞培养、转染和质粒鉴定

卵巢癌SKOV3细胞接种于含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中常规培养。取对数生长期的SKOV3细胞接种于6 cm²培养盘，待融合度达60%左右，PBS冲洗1次，加入200 μL无血清培养基。将2.4 μg质粒和9 μL转染试剂分别加入到200 μL无血清培养基，37 ℃孵育15 min后加入到培养盘中，500 mg/L遗传霉素(geneticin，G418)筛选单克隆细胞株，实时PCR、Western blotting检测REG4表达水平，取REG4高表达单克隆细胞株用于后续实验。将稳定转染pcDNA3.1-REG4的细胞株作为过表达REG4组，稳定转染pcDNA3.1空载体的细胞作为Mock组。

1.2.4 实时PCR检测

取2组对数生长期细胞，根据QIAGEN RNase minikit说明书提取总RNA，使用禽骨髓母细胞瘤病毒逆转录酶和随机引物对总RNA进行cDNA合成。按照SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ试剂盒说明书配制体系进行实时PCR反应。REG4基因扩增引物:上游5’-TAACTTGGAGCAGCAACGAATG-3’，下游5’-GGCTAGCAGAAAGGAAGAGGA-3’；内参GAPDH引物:上游5’-CAATGACCCCTTCATTGACC-3’，下游5’-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。反应条件:94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共34个循环。采用2^-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

1.2.5 Western blotting

用RIPA裂解液中提取卵巢癌和转染细胞总蛋白，并测定蛋白浓度。按浓度稀释后95 ℃ 5 min变性。变性蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜，于5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，加入2 mL抗REG4抗体(美国R & D公司)，4 ℃反应过夜。二抗采用HRP标记的羊抗兔的IgG，室温反应1 h，ECL-Plus试剂盒发光显影检测目的蛋白。

1.2.6 MTT法检测细胞增殖能力:

将细胞接种于96孔板(2×10³/孔)，每组设3个复孔，并设3个空白对照孔，常规培养。待细胞贴壁后，分别在0、24、48 h加入20 μL MTT溶液，孵育4 h后弃掉液体，并每孔加入150 μL DMSO溶解，震荡10 min，用酶标仪测定各组490 nm处吸光度值并计算增殖率，以时间为横轴、增殖率为纵轴绘制上涨曲线。

1.2.7 细胞凋亡检测

取处于对数生长期的2组细胞，收集细胞和上清液，PBS冲洗2次，用Annexin V-FITC结合缓冲液重悬至单细胞悬液，并调整其浓度为1×10⁶/mL。加入5 μL Annexin V-FITC染料，室温避光孵育15 min，再加入5 μL碘化丙啶染料孵育5 min，上流式细胞仪检测分析。

1.2.8 Transwell细胞侵袭实验

取处于对数生长期的2组细胞，以无血清培养基调整细胞浓度为2.5×10⁵/mL后接种于预先涂有基质胶的Transwell小室上层，下室加入含10%胎牛血清的培养基作为化学引诱物。24 h后用棉球擦掉上层未迁移的细胞，PBS清洗小室，黏附在下层膜的细胞经4%多聚甲醛固定并用结晶紫溶液染色，光学显微镜下(×100)选取5个随机区域照相。

1.2.9 基因富集分析

从TCGA公共数据库收集卵巢癌、REG4基因数据，进行基因集富集分析，探讨REG4在卵巢癌发生发展中的作用和机制。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。满足正态性检验的计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，进一步两两比较采用SNK-q检验。不满足正态分布者以M (P₂₅~P₇₅)表示，多组间比较采用非参数秩和检验。2组独立样本比较采用独立样本t检验，结果用3次独立实验的x±s表示。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 基因表达分析

2.1.1 REG4在卵巢癌组织中的表达

收集515例样本，其中正常卵巢组织88例，原位卵巢癌419例，复发性卵巢癌8例，分析REG4的表达。与正常卵巢组织相比(均值=0)，REG4 mRNA表达水平在卵巢癌中上调(均值=1.56)，在复发性卵巢癌中更高(均值=2.35) (P < 0.001)。见图 1。

2.1.2 REG4相关基因表达

REG4的表达与Bid (r = -0.203，P < 0.001)、Fas (r = -0.171，P < 0.001)、AIF1(r = -0.272，P < 0.001)等凋亡因子的表达呈明显负相关，而与细胞周期蛋白依赖激酶CDK4 (r = 0.205，P < 0.001)、抑凋亡因子Bcl-2 (r = 0.204，P < 0.001)、促增殖因子Raf (r = 0.118，P = 0.039)和药物代谢相关酶ALDH1A1 (r = 0.121，P = 0.036)、GSTA1 (r = 0.175，P = 0.002)、GSTA2 (r = 0.201，P < 0.001)、UGT2A3 (r = 0.192，P < 0.001)的表达呈正相关。

2.2 REG4 mRNA表达与卵巢癌患者生存率的关系

2.2.1 REG4 mRNA表达与所有卵巢癌患者生存率的关系

Kaplan-Meier Plotter分析结果显示，REG4 mRNA的高表达与所有卵巢癌患者的总体生存率、无进展生存率和后进展生存率降低相关，见图 2。

2.2.2 REG4 mRNA表达与亚组卵巢癌患者生存时间的关系

组织学分型浆液性卵巢癌、临床分期Ⅰ~Ⅳ期和病理分级Ⅱ~Ⅲ级的卵巢癌患者的总体生存率与REG4 mRNA的表达量呈负相关；组织学分型浆液性卵巢癌，临床分期Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ期和病理分级Ⅲ级的卵巢癌患者的无进展生存率与REG4 mRNA的表达量呈负相关；临床分期Ⅲ期、病理分级Ⅱ级的卵巢癌患者的后进展生存率与REG4 mRNA的表达量呈负相关；其余亚组的卵巢癌患者的总体生存率、无进展生存率和后进展生存率与REG4 mRNA的表达量均不相关。见表 1。

2.3 过表达REG4的SKOV3细胞表型

通过G418筛选，成功获得了稳定高表达REG4的单克隆细胞株SKOV3。实时PCR结果显示，过表达REG4组细胞REG4 mRNA的表达水平明显高于Mock组(P < 0.001)，Western blotting结果表明，REG4组细胞REG4蛋白的表达水平明显高于Mock组(P < 0.05)，表明其已稳定高表达REG4。见图 3A。

MTT结果显示，过表达REG4的SKOV3增殖能力明显高于Mock组(P < 0.05)，表明REG4过表达可促进卵巢癌细胞SKOV3的增殖能力。见图 3B。

流式细胞仪结果显示，REG4过表达的卵巢癌细胞SKOV3凋亡减少(P < 0.05)，表明过表达REG4可抑制卵巢癌细胞SKOV3的凋亡。见图 3C。

Transwell结果显示，过表达REG4的SKOV3穿膜细胞数量明显高于Mock组(P < 0.05)，表明REG4过表达可促进卵巢癌细胞SKOV3的侵袭能力。见图 3D。

2.4 基因富集分析

REG4在凋亡和药物代谢细胞色素P450相关基因中富集。且REG4与凋亡相关基因呈明显负相关，而与药物代谢细胞色素P450相关基因呈正相关。见图 4。

3 讨论

人REG4基因定位于染色体1q12-q21，编码158个核苷酸，蛋白分子量为17 000^[2]。本研究发现，REG4 mRNA在卵巢癌组织中表达升高，在胃癌、结直肠癌、大肠癌、胰腺导管腺癌等多种人类恶性肿瘤中均发现REG4 mRNA和蛋白表达升高^[3-4]，提示REG4表达上调参与人类恶性肿瘤的发生。人卵巢癌细胞SKOV3过表达REG4蛋白后，细胞增殖增强，凋亡抑制。BISHNUPURI等^[5]发现，REG4蛋白激活Akt/GSK3β/β-Catenin/TCF-4和EGF受体/Akt/AP-1信号通路，增加细胞周期调控基因Cyclin D1和Cyclin D3以及相关的周期蛋白依赖性激酶(CDK4和CDK6)的表达，从而促进肿瘤细胞增殖。生物信息分析发现，REG4与周期蛋白依赖性激酶CDK4的表达呈正相关，同时基因富集结果显示，REG4相关基因抑制凋亡信号通路，且REG4的表达与Bid、Fas、AIF1等凋亡因子的表达呈负相关，与抑凋亡因子Bcl-2的表达呈正相关。BISHNUPURI等^[5]的研究也证明了REG4处理结直肠癌细胞后，Bcl-2、Bcl-XL和Survivin蛋白表达增加，表明REG4能够通过调节细胞增殖和凋亡参与肿瘤发生。

卵巢癌患者的生存与卵巢癌的复发和转移密切相关。生存分析显示，亚临床分型和分级的卵巢癌中，REG4表达水平与患者生存率呈负相关。OUE等^[6]发现，大肠癌中REG4的表达与肿瘤分期相关，Ⅲ/Ⅳ期大肠癌中REG4表达频率高于Ⅰ/Ⅱ期，且直肠癌与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移和肝转移密切相关。SAUKKONEN等^[7]发现，胰腺导管腺癌中REG4的表达与肿瘤的组织学分级有关，且在肿瘤ⅠA~ⅡA期中，REG4血清水平高的患者生存期较差。本研究发现，过表达REG4的卵巢癌细胞侵袭增强。HE等^[8]发现，REG4蛋白能诱导基质金属蛋白酶7和基质金属蛋白酶9两种细胞侵袭因子表达上调。此外，本研究中REG4高表达的卵巢癌患者的总体生存率、无进展生存率和后进展生存率较低，且复发性卵巢癌患者REG4的表达高于原发性卵巢癌患者。以上数据表明，REG4可能参与卵巢癌的侵袭和转移，并因此降低卵巢癌患者的生存率。

本研究中，REG4相关基因表达分析发现，REG4与ALDH1A1、GSTA1、GSTA2、UGT2A3等药物代谢相关酶的表达呈正相关，基因富集分析显示，REG4与药物代谢细胞色素P450相关基因密切相关。JIN等^[9-10]发现，REG4蛋白能够调控Hsp27、Bcl-2的表达以及多种酪氨酸激酶受体等关键信号分子的激活，从而介导肿瘤细胞对化疗药物的耐受作用。总之，REG4不利于肿瘤的药物治疗。

综上所述，REG4能够促进肿瘤细胞周期进程、增殖和侵袭，抵抗凋亡，并能够提高肿瘤细胞对化疗药物的耐受水平，与卵巢癌的不良预后密切相关，可作为卵巢癌早期诊断、预后评价和晚期基因治疗一个新的分子靶点，以提高卵巢癌患者生存率和生存质量。