糖尿病肾病是糖尿病最严重的并发症之一，是导致我国终末期肾脏疾病的第二大病因^[1]，其发病率逐年升高。随着疾病的进展，肾脏病变不可逆转，虽积极控制危险因素，但糖尿病肾病控制情况仍不理想。早期诊治是延缓肾脏病变的有效手段，在蛋白尿这个经典诊断指标的基础上，近年来不断发现新的预测指标。但研究发现这些指标的敏感度和特异度不能很好的兼顾，因此探究新的预测指标仍是目前的研究热点。

沉默信息调节蛋白4（sirtuin 4，SIRT4）是沉默信息调节因子2家族的一员，是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性高度保守的酶。在对SIRT4的初始研究中，仅发现腺苷二磷酸-核糖转移酶活性，近年发现其还有去乙酰酶活性^[2-3]。SIRT4通过作用于不同底物，广泛参与生物代谢过程。糖脂代谢紊乱是糖尿病的危险因素，也是促进糖尿病肾病发展的主要原因。SIRT4作为一种调控糖脂代谢的蛋白酶，既往研究^[4-7]发现其在糖尿病状态下及肾脏损伤时低表达，有理由推测SIRT4与糖尿病肾病相关。因此，研究SIRT4在糖尿病肾病不同时期的表达极为重要。本研究通过检测健康体检者及糖尿病肾病患者外周血中SIRT4的表达水平，旨在探究SIRT4是否与糖尿病肾病存在相关性。

1 材料与方法 1.1 材料

RNAiso Plus试剂盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂盒、BCA试剂盒（日本TaKaRa公司）；anti-SIRT4抗体、驴抗山羊IgG（英国Acbam公司）；ECL发光试剂盒（美国Thermo公司）。基因引物（日本TaKaRa公司）：SIRT4，上游引物序列：5’-TCCACGGATGCATGGACA-3’，下游引物序列：5’-TCAGGACTTGAAACGCTCTTG-3’；GAPDH上游引物序列：5’-GCACCGTCAAGGCTGAG AAC-3’，下游引物序列：5’-TGGTGAAGACGCCAGT GGA-3’。

1.2 研究对象及分组

在2017年10月至2018年4月中国医科大学附属第一医院干诊门诊和内分泌病房诊治的患者中，参照美国糖尿病学会2012年推荐的筛查及诊断微量白蛋白尿[尿白蛋白/肌酐比值（urine albumin/creatinine ratio，UACR）]的方法筛选出正常蛋白尿组（A组，UACR < 30 mg/g，n = 30）、早期糖尿病肾病组（B组，UACR 30~300 mg/g，n = 30）、临床糖尿病肾病组（C组，UACR>300 mg/g，n = 30），共90例符合1999年世界卫生组织糖尿病诊断标准的糖尿病患者。并选取同期于健康体检中心体检的30例健康体检者作为健康对照组。排除标准：合并糖尿病急性并发症，合并泌尿系感染或者其他肾脏疾病，顽固性高血压或正在使用血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体阻断剂类药物，近期使用肾毒性药物，合并恶性肿瘤或严重感染，合并严重心脑血管疾病，未合并糖尿病视网膜病变。

1.3 研究方法

1.3.1 资料收集

收集患者基本资料及当次就诊时化验的生化指标，包括年龄、性别、糖尿病病程、收缩压、舒张压、体质量指数（body mass index，BMI）、空腹血糖、糖化血红蛋白、血肌酐、胱抑素C、总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇，并采集患者当次就诊的随机尿进行尿微量白蛋白与尿肌酐的测定，计算估算肾小球滤过率。

1.3.2 收集样本

所有研究对象于空腹状态采集外周静脉血，存于-80℃冰箱中，以备后续实验使用。

1.3.3 实时荧光定量PCR

按照试剂盒步骤提取总RNA，检测RNA浓度后测定其纯度，随后进行逆转录反应。PCR反应体系：SYBR Premix Ex Taq 25 μL，cDNA溶液4 μL，ROX Reference Dye（50×）1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，RNase Free dH₂O 18 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，40个循环。分析扩增曲线及融解曲线，计算结果。

1.3.4 Western blotting

提取细胞总蛋白，BCA方法检测蛋白浓度，进行SDS-PAGE，取待测样品上样，80 V恒压电泳，待溴酚蓝达到分离胶界面时，更改为电泳参数为120 V恒压电泳，电泳结束后转移至PVDF膜上，TBST溶液冲洗后，牛血清白蛋白溶液封闭，随后加入1:1 000稀释的SIRT4一抗，孵育过夜，TBST洗膜，之后加入1:1 000稀释的二抗，室温下孵育2 h，TBST洗膜，洗涤结束后将PVDF膜放于凝胶成像分析系统中，于膜上滴加ECL工作液（A液与B液的比例为1:1），随后曝光，采集图像。

1.4 统计学分析

所有资料采用SPSS 20.0软件进行统计。计量资料采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析及非参数检验，血SIRT4与各因素的相关性采用Pearson相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组间一般资料的比较

各组间比较，性别、年龄、收缩压、舒张压、糖化血红蛋白、总胆固醇的差异无统计学意义（P > 0.05）；C组糖尿病病程、低密度脂蛋白胆固醇较A组高，差异有统计学意义（P < 0.05）；C组BMI高于健康对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；A组、B组、C组空腹血糖高于健康对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；C组肌酐、胱抑素C、甘油三酯高于健康对照组和A组，差异有统计学意义（P < 0.05）；C组估算肾小球滤过率低于健康对照组和A组，差异有统计学意义（P < 0.05）；C组和B组UACR高于A组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。

2.2 实时荧光定量PCR结果

A、B、C组以及健康对照组SIRT4 mRNA表达水平分别为1.12±0.13、0.81±0.07、0.63±0.09、0.20±0.07。C组和B组SIRT4 mRNA的表达低于健康对照组和A组，A组SIRT4 mRNA表达低于健康对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。

2.3 Western blotting结果

A、B、C组以及健康对照组SIRT4蛋白的表达水平分别为0.48±0.04、0.39±0.05、0.29±0.04、0.19±0.02。C组和B组SIRT4蛋白的表达水平低于健康对照组和A组，A组SIRT4蛋白的表达水平低于健康对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 1。

2.4 SIRT4与各项指标的相关性分析

SIRT4与空腹血糖（r = -0.424，P < 0.001）、糖尿病病程（r = -0.382，P < 0.001）、BMI（r = -0.310，P = 0.001）、年龄（r = -0.198，P = 0.039）、总胆固醇（r = -0.237，P = 0.009）、甘油三酯（r = -0.432，P < 0.001）、血肌酐（r = -0.394，P < 0.001）、UACR（r = -0.915，P < 0.001）、胱抑素C（r = -0.391，P < 0.001）呈负相关，与估算肾小球滤过率（r = 0.404，P < 0.001）呈正相关。

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病患者最严重的并发症之一。强化血糖、血压、血脂的控制对于预防糖尿病肾病是有效的^[8]，但仍可发现糖尿病肾病的患病人数呈上升趋势。早期诊治对于延缓糖尿病肾病进展至关重要，因此寻找临床价值更高的早期诊断指标一直是目前研究的重点。

糖代谢紊乱是糖尿病肾病的一大特点，本研究中糖尿病各组的血糖均明显高于健康对照组，说明控制血糖也是糖尿病肾病患者的首要任务之一。Shi等^[5]研究发现在葡萄糖诱导的小鼠中，作为滤过屏障主要成分的足细胞凋亡以浓度依赖性增加，足细胞凋亡增加提示肾脏有损伤，与本研究结果相符，血糖控制不佳会成为促进肾功能下降的一大危险因素。

正常蛋白尿期说明患者尚未发展为糖尿病肾病，当UACR>300 mg/g时说明此时肾脏已经明显损伤，本研究发现临床糖尿病肾病组患者低密度脂蛋白与总胆固醇均较正常蛋白尿组高，差异有统计学意义，说明糖尿病肾病进展与脂代谢异常存在相关性。自1982年“脂质肾毒性”假说提出后，至今已有多个研究表明脂代谢异常可促进糖尿病肾病的进展^[9]。提示糖尿病肾病患者应注意控制血脂。

本研究发现，临床糖尿病肾病组糖尿病病程高于正常蛋白尿组，差异有统计学意义。糖尿病肾病是在糖尿病患者代谢紊乱的基础上受到多种危险因素作用，导致功能下降甚至功能衰竭。随着糖尿病患者患病时间的延长，肾脏受到危险因素作用的时间延长，损伤逐渐加重。既往研究发现，糖尿病患者出现蛋白尿多在其发病的5年后，而进入临床蛋白尿则大约需要10~15年，说明糖尿病病程的长短与糖尿病肾病的进展密切相关。

本研究中糖尿病各组SIRT4 mRNA及蛋白的表达均低于健康对照组，且糖尿病各组中随着尿蛋白排泄率的增加，SIRT4表达呈逐渐下降趋势，说明SIRT4在糖尿病肾病患者不同时期的变化是有意义的。尿蛋白排泄率目前是筛查早期糖尿病肾病的最受认可的指标之一，正常蛋白尿说明尚未发展成为糖尿病肾病，但如未及时诊治，则非常有可能发展为糖尿病肾病。本研究中SIRT4在UACR处于正常水平即正常蛋白尿时期就出现了表达减少的趋势，因此推测SIRT4可能作为肾脏损伤的早期标志物。

本研究中，SIRT4与总胆固醇、甘油三酯呈负相关，同时随着肾功能下降，SIRT4表达减少。SIRT4具有ADP-核糖转移酶活性，可以抑制脂肪酸氧化过程中的丙二酰辅酶A脱羧酶活性，进而抑制脂肪酸氧化过程。因此，有理由推测SIRT4可能通过调控脂代谢而影响糖尿病肾病的进展。

SIRT4可以参与调节脂肪酸氧化、活性氧的产生、胰岛素抵抗、足细胞凋亡等过程，上述过程均与糖尿病肾病的进展相关^[10]。本研究发现SIRT4与血糖、糖尿病病程、BMI、胆固醇、甘油三酯水平呈负相关，且随着尿蛋白排泄率增加而表达减少，说明SIRT4在体内可能是通过参与调控上述生物过程影响糖尿病肾病进展。

本研究中SIRT4表达水平与UACR、血肌酐、胱抑素C呈负相关，与估算肾小球滤过率呈正相关，而上述指标均可以在一定程度上反映肾脏功能，说明SIRT4在一定程度上也可以反映肾脏损伤的程度，有助于判断疾病的进展程度。