子痫前期（preeclampsia，PE）是孕妇在妊娠期特有的疾病，严重威胁母胎健康。重度子痫前期（severe preeclampsia，SPE）及其并发症，如胎盘早剥、脑出血、胎儿生长受限等，是导致孕产妇和围产儿病死率升高的主要原因之一^[1]。以孕34周为界，发病孕周 < 34周为早发型重度子痫前期（early-onset severe preeclampsia，ESPE），34周后为晚发型重度子痫前期（late-onset severe preeclampsia，LSPE）^[2]。SPE病因至今尚不清楚，有学者^[3]认为ESPE与滋养层细胞浸润不足和子宫螺旋小动脉重铸障碍有关；而LSPE与母体血管系统对妊娠的高敏感性和胎盘动脉硬化有关。MOL等^[1]的研究表明，病理性妊娠时胎盘中某些相关蛋白出现异常表达，引起滋养细胞生物学行为失常，导致SPE发生。

Staufen蛋白是JOHNSTON在果蝇中发现的含有126个氨基酸的蛋白质，在果蝇胚胎发育过程中，参与细胞中mRNA的转运和翻译，属于双链RNA结合蛋白（double-stranded RNA binding protein，DRBP）家族。哺乳动物细胞中，Staufen蛋白有2个同源蛋白，即Staufen1（STAU1）和Staufen2，其中Staufen2蛋白只在神经元细胞中表达，而STAU1蛋白在机体各组织中都有表达^[4]。研究^[4-6]表明，STAU1蛋白可以与细胞中mRNA的3’-非翻译区（3’-UTR）结合，诱导mRNA降解，在细胞的发育、分化和凋亡中发挥着重要作用。研究^[7]表明，STAU1蛋白还参与了胃癌的发生。胎盘滋养细胞的生物学行为与肿瘤细胞行为存在类似性，因此推测STAU1可能也参与了胎盘组织生物学行为的调节，并参与了SPE发生的调控。本研究拟通过检测STAU1在SPE胎盘组织中的表达情况，探讨其在PE发病中的作用，为临床早期诊断和治疗PE提供依据。

1 材料与方法 1.1 研究对象和分组

选取2016年5月至2018年4月在中国医科大学附属盛京医院住院剖宫产分娩的SPE孕妇30例作为SPE组，并将其进一步分为ESPE组（15例）和LSPE组（15例）；另选同期剖宫产分娩的正常妊娠孕妇30例作为对照组（N组），其中，孕周与ESPE组相对应者（EN组）10例，孕周与LSPE组相对应者（LN组）20例。SPE组和N组孕妇均为单胎、剖宫产分娩，排除生殖器官畸形、多胎及其他妊娠相关合并症（如妊娠期糖尿病、原发性高血压、慢性肾炎等），其中，EN组常由宫颈机能不全、胎膜早破、前置胎盘、孕妇合并严重先天性疾病等病因而终止妊娠。

SPE的诊断标准依据《妇产科学》第8版^[2]。本研究经中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准（伦理批号：2017PS230K），符合医学伦理学规定，所有参加研究的孕妇及家属均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本收集

取剖宫产分娩后的无菌胎盘组织（在胎盘母体面距离脐带附着处2~3 cm范围取材，避开机化灶、钙化灶、出血灶等），用无菌生理盐水反复冲洗，分割成1 cm×1 cm×1 cm组织块，保存于液氮，用于提取RNA和蛋白质。另取1 cm×1 cm×1 cm组织块，4%多聚甲醛保存，行石蜡包埋、切片，用于免疫组织化学检测。

1.2.2 实时荧光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）

取约50 mg胎盘组织，采用RNA iso试剂盒（日本TaKaRa公司）提取总RNA，检测RNA浓度，采用5X-ALL-In-One RT MasterMix试剂盒（加拿大abm公司）逆转录生成cDNA。行PCR，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，40个循环，分析溶解曲线及循环阈值（cycle threshold，Ct），每个样本重复3次，取平均值。采用2^-△△Ct法计算STAU1 mRNA经内参18S RNA标化后的相对表达水平。引物序列见表 1。

1.2.3 Western blotting

取约50 mg胎盘组织，提取蛋白质，BCA法检测蛋白浓度，变性后保存于-20 ℃。行凝胶电泳，转膜60 min，5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入兔抗人STAU1多克隆抗体（1︰500稀释，美国Signalway公司）和兔抗人GAPDH多克隆抗体（1︰1 000稀释，杭州贤至生物科技有限公司），4 ℃过夜。复温30 min后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体（1︰5 000稀释，北京中杉金桥生物技术有限公司）孵育2 h。ECL显色，应用Biosystems azure C300成像系统采集图像并分析。

1.2.4 免疫组织化学检测

取4%多聚甲醛固定后的胎盘组织，石蜡包埋48 h后，制石蜡切片，厚3~4 μm。采用免疫组织化学检测试剂盒（中国福州迈新生物技术开发有限公司）行免疫组化染色。石蜡切片经脱蜡、封闭内源性过氧化物酶30 min，柠檬酸缓冲液抗原修复7 min，封闭非特异性抗原/电荷45 min，加入一抗（STAU1 1︰200稀释），4 ℃孵育10~12 h，二抗（生物素标记的羊抗兔/鼠IgG）孵育30 min，DAB显色，苏木素复染核3~5 min，棕黄色为阳性。应用NIS-Elements软件（日本Nikon公司）对图像进行采集分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，计量资料用x±s表示，采用t检验或非参数检验（如Mann-Whitney U检验）行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 基本资料

ESPE组和EN组及LSPE组和LN组患者的年龄、孕周间均无统计学差异（P>0.05），而ESPE组和LSPE组的收缩压、舒张压及24 h尿蛋白定量均显著高于同期妊娠对照组，差异有统计学意义（P < 0.001）。见表 2。

2.2 胎盘组织中STAU1 mRNA的表达情况

SPE组胎盘组织中STAU1 mRNA的表达水平（0.844±0.074）显著低于N组（1.096±0.057），差异有统计学意义（P < 0.01）；其中，ESPE组胎盘组织中STAU1 mRNA的表达水平（0.683±0.061）显著低于EN组（1.015±0.060），差异有统计学意义（P < 0.01），而LSPE组胎盘组织STAU1 mRNA表达水平（1.005±0.124）与LN组（1.136±0.080）比较无统计学差异（P>0.05），见图 1。

2.3 胎盘组织中STAU1蛋白的表达情况

SPE组胎盘组织中STAU1蛋白的表达水平（0.916±0.102）显著低于N组（1.573±0.135），差异有统计学意义（P < 0.001）；其中，ESPE组胎盘组织中STAU1蛋白表达水平（0.719±0.101）显著低于EN组（2.025±0.155），差异有统计学意义（P < 0.001），而LSPE组胎盘组织STAU1蛋白表达水平（1.112±0.165）与LN组（1.337±0.165）比较无统计学差异（P>0.05），见图 2。

2.4 胎盘组织中STAU1蛋白的表达定位情况

4组胎盘组织的细胞滋养细胞和合体滋养细胞细胞中均有STAU1蛋白的表达，且主要在合体滋养细胞的细胞质中表达，其中ESPE组STAU1蛋白表达水平显著低于EN组（0.014±0.008 vs 0.019±0.002，P < 0.001），LSPE组与LN组则无统计学差异（0.011±0.001 vs 0.012±0.003，P>0.05），见图 3。

3 讨论

PE是指妊娠20周后孕妇出现高血压并存在多器官及系统受累，严重影响孕产妇及围产儿健康，尤其SPE及其严重的并发症是导致母婴死亡的重要原因。研究^[1]发现PE存在多因素、多机制、多通路发病机制，但具体的发病机制仍不明确。在妊娠早期，细胞滋养细胞促使子宫螺旋动脉发生重构，拟合并替代胎盘组织中的血管内皮细胞和部分血管平滑肌，使子宫螺旋小动脉从高排低阻状态变成低排高阻状态，建立有效的母体和胎儿之间的营养物质交换，维持母体正常妊娠及胎儿的正常发育。同时，滋养细胞浸润行为受到时间和空间的严格调控，滋养细胞浸润过浅可能会导致PE的发生^[8]。目前，研究^{[3, 9]}发现多种基因参与滋养细胞浸润能力的调控，如TINP-1、KIR2DL1、MMPs等。

STAU1蛋白是一种含有多个双链RNA的RNA结合蛋白^[10]。SUGIMOTO等^[11]研究发现，STAU1蛋白具有mRNA和长非编码RNA的结合区域，能分别与其3’-UTR和5’-UTR端结合，参与mRNA的转运、局部翻译和RNA代谢、加工等生物学功能^[12]。BONNET-MAGNAVAL等^[13]研究发现，STAU1还是一种应激反应基因，正常生理情况下，STAU1 mRNA可以与内部核糖体进入位点（internal ribosome entry sites，IRES）相结合，启动编码细胞内质网中抗氧化蛋白mRNA的翻译，使细胞具有抗氧化应激的保护作用。KRETZ等^[6]研究发现，STAU1可与LncRNA相结合，并在人表皮细胞分化过程中发挥着重要的作用。SAKURAI等^[14]研究发现，敲低STAU1能够恢复ADAR1敲低引起的应激细胞凋亡，在胃癌细胞中，STAU1可与CDKN2B mRNA的3’-UTR结合，降解CDKN2B，促进胃癌细胞增殖^[7]。提示STAU1在正常细胞及肿瘤细胞中发挥着重要的作用，而目前尚无关于STAU1在胎盘滋养细胞中的表达情况及其对SPE影响的研究。

本研究发现，STAU1 mRNA和蛋白在胎盘合体滋养细胞和细胞滋养细胞中均有表达，其中以合体滋养细胞为主；通过比较发现，SPE组（ESPE组和LSPE组）STAU1 mRNA和蛋白的表达均低于N组，表明STAU1很有可能参与了SPE的发病机制，其中STAU1 mRNA和蛋白在ESPE组的表达低于EN组，提示STAU1可能与子宫螺旋小动脉重铸障碍有关，导致滋养层细胞浸润能力不足，从而参与PE的发病；而LSPE组STAU1 mRNA和蛋白的表达与LN组无统计学差异，可能是由于LSPE的发生主要与内皮细胞损伤及胎盘动脉硬化、全身系统性免疫炎症反应有关^[15]，进一步说明STAU1蛋白可能在滋养细胞浸润行为中发挥着重要的作用。

综上所述，本研究结果表明，STAU1的表达水平可能与SPE的发病有关，尤其与ESPE的发生相关。