2019, Vol. 48文章信息
- 成冬, 郭磊, 姜天龙, 周仁义, 刘文博, 罗鹏, 梅润宏, 杨旭浩
- CHENG Dong, GUO Lei, JIANG Tianlong, ZHOU Renyi, LIU Wenbo, LUO Peng, MEI Runhong, YANG Xuhao
- 17β-雌二醇通过GPR30和PI3K/Akt信号通路影响ATDC5软骨细胞线粒体自噬的机制
- 17β -Estradiol Protects ATDC5 Chondrocytes from Mitochondrial Autophagy via G-Protein Coupled Estrogen Receptor-30 and PI3K/Akt Signaling Pathways
- 中国医科大学学报, 2019, 48(4): 289-294
- Journal of China Medical University, 2019, 48(4): 289-294
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文章历史
- 收稿日期：2018-06-19
- 网络出版时间：2019-04-13 15:00
引用本文 |
线粒体自噬是一种选择性自噬，通过自噬体-溶酶体系统去除损伤和功能障碍的线粒体，确保细胞内线粒体功能稳定和细胞存活。软骨细胞是关节软骨的唯一细胞类型，线粒体功能影响软骨细胞存活，因此线粒体自噬与骨性关节炎（osteoarthritis，OA）的发病紧密相关[1]。最近发现17β-雌二醇不仅与氧化应激、炎症反应和细胞凋亡有关，还与自噬相关。已有研究[2]证明，在Raw 264.7细胞中17β-雌二醇可以通过激活PI3K/Akt信号转导通路降低氧化应激和炎症反应。17β-雌二醇可以通过ER-ERK-mTOR途径促进成骨细胞自噬，保护成骨细胞免受无血清诱导的细胞凋亡[3]。G蛋白耦联雌激素受体30（G-protein coupled estrogen receptor-30，GPR30）是一种7次跨膜G蛋白耦联雌激素受体，能介导快速的细胞反应。细胞自噬中，新合成的微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）经剪切修饰变成胞浆蛋白LC3-Ⅰ，之后转变为LC3-Ⅱ，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，参与自噬体的伸展扩张。TOM20是线粒体外膜复合体转位亚基，参与线粒体前体蛋白转运，被认为是线粒体自噬的潜在标志物[4]。热休克蛋白60（heat shock protein 60，Hsp60）主要定位于线粒体内，可通过催化过氧化氢还原成水，保护线粒体免于活性氧（reactive oxygen species，ROS）诱导的损伤。新的证据表明，雌激素可通过GPR30对脊髓损伤进行保护；可通过改变PI3K/Akt-mTOR信号通路调节细胞自噬，从而降低脊髓损伤后的损伤程度[5]。本研究拟探讨17β-雌二醇是否通过抑制线粒体自噬保护ATDC5软骨细胞，以及17β-雌二醇是否通过GPR30/PI3K/Akt途径调节线粒体自噬。
1 材料与方法 1.1 试剂和抗体17β-雌二醇购自美国Sigma-Aldrich公司。含有L-谷氨酰胺和HEPES以及胎牛血清的DMEM/F12购自美国Logan公司。选择性GPR30拮抗剂（G15）购自美国Tocris Bioscience公司。P38抑制剂、JNK抑制剂、PI3K抑制剂、抗-GPR30（sc-48525-R，多克隆，WB 1:200，IF 1:50）、抗Lamp2（sc-8100，多克隆，IF 1:50）、抗TOM20（sc-11415，多克隆，WB 1:200，IF 1:50）、抗-LC3（sc-376404，单克隆，WB 1:100）和抗Hsp60（sc-1052，多克隆，WB 1:200）均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。Anti-Total/phosphor-Akt购自美国Abcam公司。具有alexa fluor 555标记的驴抗兔IgG（P0179）的免疫荧光染色试剂盒购自中国江苏Beyotime Biotechnology公司。IFKine®绿色结合驴抗山羊IgG（A24231）购自美国Abbkine公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养购买小鼠软骨原代细胞系ATDC5（中国南京Kebai公司）。用含有5%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养ATDC5细胞。将细胞在37 ℃含有5%CO2的湿化培养箱中培养。每2 d更换1次培养基。在无血清培养基中培养24 h后，将细胞用不同浓度的17β-雌二醇（0 mol/L，10-9 mol/L，10-8 mol/L和10-7 mol/L，含或不含15 μmol/L的G15或20 μmol/L的LY294002）处理24 h。
1.2.2 免疫荧光染色（immunofluorescence staining，IF）分析将ATDC5软骨细胞在24孔板中培养孵化后，用4%多聚甲醛固定并加入0.1 mol/L磷酸盐（pH7.3）缓冲30 min。标本固定后，用PBS洗涤10 min。用0.1%TritonX-100处理细胞30 min以透化细胞膜，再用PBS洗涤10 min。用含有5%牛血清白蛋白的TBST封闭30 min，加入特异性一抗Lamp2抗体（1:50），TOM20抗体（1:50）或GPR30抗体（1:50），4 ℃过夜。用PBS洗涤细胞10 min，并加入二抗IgG（A24231，1:1 000）和IgG（P0179，1:1 000）反应30 min。DAPI染色5 min后，PBS洗涤15 min。通过Olympus FV1000共焦激光扫描显微镜观察，峰值发射波长在518 nm（绿色）和565 nm（红色）。
1.2.3 Western blotting用PBS洗涤ATDC5软骨细胞，通过加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（中国Beyotime公司）和磷酸酶抑制剂（中国KeyGen公司）的放射性免疫沉淀测定缓冲液（中国Beyotime公司）获得总蛋白质；用BCA蛋白质测定试剂盒（中国Beyotime公司）测定其浓度。采用SDS-PAGE分离样品，转移蛋白至PVDF，70 V处理1.5 h。为了阻断非特异性结合，室温下将PVDF膜在脱水脱脂牛乳中处理120 min，用含Tween 20的TBS洗涤3次，持续30 min。加入一抗，在4 ℃下孵育过夜。TBST洗涤30 min，与辣根过氧化物酶缀合的抗物二抗体室温下孵育2 h。TBST洗膜3次共30 min，采用BeyoECL plus试剂盒使蛋白质显像。
1.2.4 细胞活力和增殖检测将ATDC5软骨细胞接种于96孔板（2×103/孔），培养24 h。将细胞转移至不含血清的DMEM/F12培养基中（含有17β-雌二醇10-7 mol/L），37 ℃孵育24 h后，加入10 μL MTT试剂（5 mg/mL），37 ℃孵育4 h。除去培养基，用100 μL二甲基亚砜溶去甲臜晶体。所有实验均重复3次。参考570 nm波长，使用酶标仪（光谱最大加384微板读数器，德国Ismaning公司）测量光密度。
1.3 统计学分析采用SPSS 15.0软件进行统计分析。数据以x±s表示。采用Shapiro-Wilk检验评估正态性，用Bartlett方法评估方差齐性。数据的同质性采用Student’s t检验或单向方差分析（ANOVA）验证，随后进行LSD检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 17β-雌二醇增强ATDC5软骨细胞中GPR30的表达Western blotting分析（图 1A、1B）和IF染色（图 1C）结果显示，GPR30在ATDC5中有表达。用不同浓度的17β-雌二醇（0，10-9，10-8和10-7 mol/L，含或不含15 μmol/L的G15）处理ATDC5软骨细胞24 h，结果显示17β-雌二醇以剂量依赖性方式提高GPR30的表达水平，浓度为10-7 mol/L时GPR30表达水平最高（P < 0.05）（图 1A、1B）。此外，Western blotting结果还显示GPR30表达水平以时间依赖性方式递增（图 1A）。IF染色显示，17β-雌二醇提高了GPR30在细胞膜和细胞质中的表达（P < 0.05）（图 1C）。
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| A, using Western blotting to detect the expression of GPR30 protein in 17β-estradiol-treated (concentration: 10-7mol/L, time: 2 h) ATDC5 chondrocytes; B, using Western blotting to detect the activation of GPR30 protein in 17β-estradiol and G15 pretreated ATDC5 chondrocytes; C, IF staining of ATDC5 chondrocytes stained for GPR30 (red), nuclei were stained with 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blue). *P < 0.05 vs control. 图 1 17β-雌二醇增强ATDC5软骨细胞内GPR30的表达 Fig.1 17β-estradiol can stimulate the activation of GPR30 expression in ATDC5 chondrocytes |
2.2 17β-雌二醇通过调节ATDC5细胞中LC3、TOM20和Hsp60的磷酸化抑制线粒体自噬
为了解17β-雌二醇对线粒体自噬蛋白质活性的影响，本研究检测了LC3、TOM20和Hsp60的表达。与对照组相比，用17β-雌二醇处理的细胞LC3-Ⅱ的表达水平显著降低；而17β-雌二醇和G15或PI3K抑制剂对细胞内LC3-Ⅱ的表达没有影响（图 2）。与对照组相比，用17β-雌二醇处理的细胞内TOM20和Hsp60的表达水平更高；而G15或PI3K抑制剂对TOM20和Hsp60的表达没有影响（图 3）。
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| Expression levels of LC3 (A), TOM20 (B), and Hsp60 (C) protein in ATDC5 chondrocytes treated with 17β-estradiol (10-7 mol/L) with or without G15 and PI3Ki by Western blotting. The figures represent three experiments. *P < 0.05. 图 2 17β-雌二醇通过ATDC5细胞中GPR30/PI3K/Akt通路调控LC3、TOM20和Hsp60的表达 Fig.2 17β-estradiol regulates the expression of LC3, TOM20, and Hsp60 in mitophagy through the GPR30/PI3K/Akt pathway in ATDC5 cells |
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| Expression levels of p-Akt (A), p-mTOR (B), p-P38 (C) and p-JNK (D) protein in ATDC5 chondrocytes treated with 17β-estradiol (10-7mol/L) with or without G15, PI3Ki, mTORi, P38i and JNKi by Western blotting. The figures represent three experiments. *P < 0.05. 图 3 17β-雌二醇通过ATDC5细胞中GPR30/PI3K/Akt通路调节线粒体自噬。 Fig.3 17β-estradiol regulates mitophagy through the GPR30/PI3K/Akt pathway in ATDC5 cells |
2.3 17β-雌二醇通过GPR30/PI3K/Akt途径保护ATDC5软骨细胞
Western blotting结果显示，用17β-雌二醇处理的细胞Akt磷酸化水平升高，总Akt表达水平保持不变。当用G15（15 μmol/L）或PI3K抑制剂（20 μmol/L）处理细胞时结果相反（图 2），表明ATDC5细胞中17β-雌二醇（10-7 mol/L）可以通过GPR30激活PI3K/Akt途径。此外，mTOR磷酸化（p-mTOR）的抑制程度可作为自噬途径活化的指标。结果显示，17β-雌二醇（10-7 mol/L）可提高ATDC5细胞内p-mTOR的水平，而在用G15或mTORi（10-7 mol/L）处理的细胞中则结果相反（图 3），表明ATDC5细胞中17β-雌二醇可通过GPR30激活p-mTOR，抑制线粒体自噬。
此外，17β-雌二醇对ATDC5细胞的作用可以被GPR30抑制剂、PI3K抑制剂或mTORi消除（图 2、3），表明17β-雌二醇通过GPR30/PI3K/Akt途径抑制线粒体自噬。
为了确定雌二醇是否通过GPR30/JNK或GPR30/P38途径保护ATDC5软骨细胞，用添加或不添加JNK抑制剂（10 μmol/L）、P38抑制剂（10 μmol/L）或G15（15 μmol/L）或混合2种抑制剂的17β-雌二醇（10-7 mol/L）处理无血清培养的ATDC5细胞24 h。结果表明，用17β-雌二醇处理的ATDC5细胞中，P38和JNK没有磷酸化改变；用G15、P38抑制剂或JNK抑制剂处理细胞，也未观察到相反的结果（图 3）。MTT结果显示，17β-雌二醇处理的ATDC5软骨细胞的增殖和活力显著高于对照组（P < 0.05），且ATDC5软骨细胞的增殖和活力可被G15和PI3K抑制剂减弱（图 4）。提示17β-雌二醇可通过GPR30/PI3K/Akt途径促进无血清培养的ATDC5软骨细胞的增殖和活力。
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| Analysis of proliferation and viability of ATDC5 chondrocytes treated with or without 17β-estradiol, G15 and PI3Ki by MTT. The figures represent three experiments. *P < 0.05. 图 4 17β-雌二醇通过GPR30 PI3K/Akt通路调节ATDC5软骨细胞增殖与活力 Fig.4 17β-estradiol can protect ATDC5 chondrocytes via the GPR30/PI3K/Akt pathway |
3 讨论
研究发现，用雌二醇处理的ATDC5细胞中含有较少的自噬体，经雌二醇处理的ATDC细胞中TOM20阳性颗粒与Lamp2[6]减少，表明线粒体自噬在ATDC5细胞中可被17β-雌二醇抑制。然而，雌激素保护软骨细胞免受损害的分子机制目前尚未明确。本研究结果显示，用17β-雌二醇处理的ATDC5细胞增殖和活力显著高于对照组，证实了17β-雌二醇对软骨细胞的保护作用。
氧化应激可导致线粒体损伤，如果损伤超过线粒体内膜的膜电位，则功能失调的线粒体将通过自噬途径被去除，也称线粒体自噬。细胞虽可通过线粒体自噬途径去除氧化应激损伤的线粒体，保护细胞免于凋亡，但过量的线粒体自噬将导致大量重要细胞成分减少，从而导致细胞死亡[7]。已有研究表明，自噬可能是通过消除生长促进分子和细胞器，如蛋白质p62，降低细胞的生长速率。当p62耗竭或去除时，mTOR不能被激活，导致细胞生长受限[8]。针对过量的自噬，线粒体能够采用其他机制，如融合/裂变周期以及线粒体解折叠蛋白反应的胞内质控机制，来修复或去除受损的线粒体，以确保线粒体维持其正常功能[9]。细胞还可通过增加线粒体伴侣蛋白（Hsp60，Hsp70）和蛋白酶表达激活线粒体解折叠蛋白反应途径，以保护线粒体免于功能障碍。血清饥饿培养的HeLa细胞可诱导线粒体自噬，随着LC3-Ⅱ表达的增加可降低TOM20的表达[10]。本研究也发现，LC3-Ⅱ的表达水平下降，而Hsp60和TOM20的表达水平上升。因此，17β-雌二醇可能通过抑制线粒体自噬来保护ATDC5软骨细胞，并有助于修复线粒体损伤。
本研究结果发现，17β-雌二醇可通过GPR30和PI3K/Akt-mTOR信号通路抑制ATDC5细胞线粒体自噬，表明PI3K/Akt-mTOR信号通路可作为治疗OA的新途径。已有研究[11-12]表明，17β-雌二醇可通过结合心肌细胞和癌细胞内的GPR30受体执行其生理功能。本研究发现，GPR30在ATDC5软骨细胞中也有表达，17β-雌二醇（0，10-9，10-8和10-7 mol/L）以剂量依赖性方式增加GPR30的表达水平，提示17β-雌二醇可能通过作用于GPR30发挥其生理调节功能。Western blotting结果显示，17β-雌二醇对ATDC5软骨细胞GPR30表达水平的诱导具有时间依赖性，此诱导作用可被GPR30拮抗剂阻断，导致LC3-Ⅱ高表达，TOM20和Hsp60低表达。提示17β-雌二醇可能是通过GPR30抑制线粒体自噬。
本研究结果显示，用17β-雌二醇培养ATDC5软骨细胞24 h后，细胞内Akt磷酸化水平增加，总Akt表达水平保持不变。据文献报道，mTOR受PI3K正调控，是自噬的负调控因子。与对照组相比，用17β-雌二醇处理的ATDC5细胞中p-mTOR的表达水平显著升高。17β-雌二醇对ATDC5细胞的作用可被GPR30抑制剂、PI3K抑制剂或mTORi消除，表明17β-雌二醇通过GPR30/PI3K/Akt途径抑制线粒体自噬。已有研究[13]发现，17β-雌二醇通过PI3K/Akt信号通路抑制肿瘤坏死因子-α诱导人髓核细胞凋亡。17β-雌二醇还可以通过PI3K/Akt/caspase-3途径降低大鼠髓核细胞的凋亡发生率[3-5]。此外，PI3K/Akt信号转导与线粒体氧化应激负相关，而PI3K/Akt信号转导的激活能减少ROS的产生[14-15]。本研究中，为了验证17β-雌二醇是否也可以通过JNK和P38调节线粒体自噬，用P38抑制剂和JNK抑制剂预处理细胞30 min，结果发现处理前后细胞内p-P38和P-JNK的水平无统计学差异。表明17β-雌二醇不能通过JNK或P38信号传导途径调控线粒体自噬。
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