2019, Vol. 48文章信息
- 唐艳阁, 王敬, 杨家祥
- TANG Yange, WANG Jing, YANG Jiaxiang
- 津力达颗粒对糖负荷小鼠血糖及相关因子的调节作用
- Regulatory Effects of Jinlida Granules on Blood Glucose and Related Factors in Mice with Sugar Stress
- 中国医科大学学报, 2019, 48(2): 159-163
- Journal of China Medical University, 2019, 48(2): 159-163
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文章历史
- 收稿日期：2017-11-14
- 网络出版时间：2019-01-02 13:25
引用本文 |
2. 河北省中医院骨伤二科, 石家庄 050000
2. The Second Department of Orthopaedics, Hebei Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050000, China
糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种代谢紊乱综合征，是由遗传、免疫功能紊乱、自由基毒素、微生物感染等多种因素引起的胰岛功能减退或胰岛素抵抗[1]。DM在发达国家的发病率约为8%，在发展中国家约为3%。DM是目前全球发病率和死亡率最高的5种疾病之一，DM的防治迫在眉睫[2]。
传统的中医理论中，DM的产生与脾的运化功能失调有关。津力达颗粒是一种中药降糖药物，它以人参、地黄、黄连和葛根作为主要成分，通过生津运脾、益气养阴改善胰岛功能，目前在临床上对DM的治疗有一定效果。研究[3-5]认为，津力达颗粒可以促进胰岛素分泌，改善胰岛素抵抗，保护胰岛β细胞。本研究拟观察津力达颗粒对糖负荷小鼠血糖、体质量、血脂、脂质过氧化能力、肝肾损伤以及胰腺组织内核转录因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）及其下游炎性细胞因子的影响，旨在明确津力达颗粒对DM的防治机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物昆明小鼠36只，由我院实验动物中心提供。体质量22~28 g，于25 ℃、50%空气湿度条件下饲养。本研究获得我院动物伦理委员会批准。
1.1.2 主要试剂津力达颗粒干粉（石家庄以岭药业股份有限公司），戊巴比妥钠（上海西唐生物公司），阿卡波糖（拜耳医药保健有限公司），蔗糖、可溶性淀粉（国药制药），丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。NF-κB、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、GAPDH抗体（美国Santa cruze公司）、二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
1.2 方法 1.2.1 实验动物分组将正常昆明小鼠36只随机分为3组，每组12只，分别为阳性对照组（阿卡波糖10 mg/kg灌胃）、实验组（津力达颗粒75 mg/kg灌胃）和空白对照组（生理盐水0.2 mL/10 g灌胃）[5]。
1.2.2 单次灌胃采血方法小鼠购入后适应性喂养3 d。禁食16 h后，从小鼠尾尖取血，测量血糖作为0 min血糖值。取血后立即给予蔗糖溶液（2 g/kg）或淀粉溶液（2 g/kg）灌胃，灌胃后给予不同药物（阿卡波糖/津力达颗粒/生理盐水），分别于30、60、120 min后测血糖。
1.2.3 连续灌胃采血方法给予小鼠阿卡波糖/津力达颗粒/生理盐水连续灌胃10 d。禁食16 h后，从小鼠尾尖取血，测量血糖作为0 min血糖值。取血后立即灌胃蔗糖溶液（2 g/kg）或淀粉溶液（2 g/kg）及不同药物，分别于30、60、120 min后测血糖。
1.2.4 连续灌胃小鼠肝脏SOD、MDA活力测定给予小鼠阿卡波糖/津力达颗粒/生理盐水连续灌胃10 d后，颈椎脱位法处死小鼠，迅速取出肝脏，用生理盐水洗净，取0.5 g肝脏匀浆，离心后取上清按照试剂盒说明书操作，分别在650 nm或532 nm波长下测定吸光度，计算SOD或MDA活力。
1.2.5 连续灌胃小鼠体质量的测定小鼠连续灌胃前及灌胃不同药物10 d后，空腹称体质量并记录。
1.2.6 连续灌胃小鼠血清生化学指标测定小鼠连续灌胃前及灌胃不同药物10 d后，颈椎脱位法处死，取血1 mL，静置3 h后，3 000 r/min离心5 min，取上清，用全自动生化仪检测甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、尿素氮（urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）、总蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）。
1.2.7 Western blotting3组小鼠药物连续灌胃10 d后，颈椎脱位法处死，迅速取出胰腺组织，用生理盐水洗净，取胰腺组织用RIPA裂解匀浆，提取蛋白，通过G250定量，取30 μg蛋白进行电泳（80~120 V）、转膜（100 V，1 h）后，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入一抗（NF-κB 1︰300，IL-1β 1︰300，IL-6 1︰300，GAPDH 1︰500），4 ℃过夜，TBST清洗3次。加入山羊抗兔二抗（1︰5 000），室温孵育1 h后，TBST清洗3次。ECL发光。
1.3 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。采用t检验比较实验组与对照组数据。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 不同药物灌胃对蔗糖/淀粉负荷小鼠血糖的影响分别于蔗糖或淀粉负荷后0、30、60和120 min测量3组小鼠血糖值，结果发现，津力达颗粒灌胃1次后30 min即可降低蔗糖或淀粉负荷小鼠的血糖水平（P = 0.047，P = 0.028），60 min时津力达颗粒对血糖的抑制依然明显（P = 0.032，P = 0.019），120 min时实验组与阳性对照组及空白对照组血糖水平无统计学差异，提示津力达颗粒能显著降低餐后2 h内血糖。连续灌胃津力达颗粒10 d对蔗糖或淀粉负荷小鼠血糖的抑制作用更为显著，与空白对照组比较，差异有统计学意义（30 min：P = 0.002，P = 0.009；60 min：P = 0.002，P = 0.006），见图 1。
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| A, effect of Jinlida granules on blood glucose of mice after sucrose load; B, effect of Jinlida granules on blood glucose of mice after starch load; C, effect of Jinlida granules on blood glucose of mice after sucrose load by avaging continuously; D, effect of Jinlida granules on blood glucose of mice after starch load by avaging continuously. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control. 图 1 津力达颗粒对小鼠血糖的影响 Fig.1 Effect of Jinlida granules on blood glucose of mice |
2.2 不同药物灌胃对小鼠体质量的影响
连续灌胃10 d后，各组小鼠体质量均随时间推移稳步上升，但灌胃后3组小鼠体质量无统计学差异，见表 1。
| Group | Before lavage | After lavage |
| Control | 30.98±0.93 | 33.82±1.42 |
| Jinlida | 31.09±0.69 | 33.19±0.73 |
| Acarbose | 30.65±1.04 | 34.01±0.95 |
2.3 不同药物灌胃对小鼠肝脏SOD和MDA的影响
ELISA检测结果发现，与空白对照组相比，药物灌胃10 d后，津力达颗粒可以显著提高小鼠肝脏内SOD活力（P = 0.003），降低MDA含量（P = 0.006），见表 2。
| Group | SOD（U/mg） | MDA（nmol/mg） |
| Control | 169.98±21.39 | 6.34±1.48 |
| Jinlida | 180.38±33.281） | 5.38±0.941） |
| Acarbose | 198.24±38.271） | 4.23±1.931） |
| 1）P < 0.01 vs control group. MDA，malondialdehyde；SOD，superoxide dismutase. | ||
2.4 不同药物灌胃对血清生化学指标的影响
血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平是反映血脂的重要指标，连续灌胃津力达颗粒10 d后，血清TG水平显著降低，TC、HDL-C和LDL-C改变不明显。BUN和Cr是反映肾功能的重要指标，药物对肾脏无不良影响是药物安全使用的前提，本研究中给予小鼠津力达颗粒灌胃后，BUN和Cr与对照组相比未见显著变化，提示未对肾脏造成不良影响。通过检测津力达颗粒对血清TP和ALB水平的影响发现，津力达颗粒几乎不影响血清内的蛋白水平。AST及ALT/AST检测结果显示，津力达颗粒并不影响小鼠ALT/AST值，提示未造成肝脏损伤。本研究结果还显示，连续灌胃津力达颗粒及阿卡波糖均可显著下调小鼠血清LDH水平（P = 0.032/P = 0.019），说明二者对小鼠的心肌细胞均有一定的保护作用。见表 3。
| Index | Control group | Jinlida group | Acarbose group |
| TC（mmol/L） | 2.49±0.09 | 2.43±0.17 | 2.25±0.59 |
| TG（mmol/L） | 0.83±0.02 | 0.75±0.031） | 0.71±0.111） |
| HDL-C（mmol/L） | 0.73±0.12 | 0.68±0.28 | 0.81±0.51 |
| LDL-C（mmol/L） | 1.62±0.26 | 1.51±0.33 | 1.57±0.29 |
| BUN（mmol/L） | 9.65±2.09 | 9.37±1.48 | 9.23±2.91 |
| Cr（μmol/L） | 13.98±1.98 | 13.84±0.94 | 14.02±1.26 |
| TP（g/L） | 54.87±1.35 | 55.23±0.98 | 54.92±1.37 |
| ALB（g/L） | 34.27±2.39 | 33.98±0.92 | 34.02±1.11 |
| AST/ALT | 4.52±0.38 | 4.56±0.26 | 4.51±0.37 |
| LDH（U/L） | 2 118.32±129.94 | 1 825.38±184.281） | 1 762.43±152.231） |
| 1）P < 0.05 vs control. TG，triglyceride；TC，total cholesterol；HDL-C，high density lipoprotein cholesterol；LDL-C，low density lipoprotein cholesterol；BUN，urea nitrogen；Cr，creatinine；TP，total protein；ALB，albumin；AST，aspartate aminotransferase；ALT，alanine aminotransferase；LDH，lactate dehydrogenase. | |||
2.5 不同药物灌胃对炎性细胞因子的影响
NF-κB可以通过调节下游炎症通路影响DM的进程，Western blotting结果显示，津力达颗粒可以在一定程度上抑制胰岛中NF-κB及其下游IL-1β和IL-6的表达，见图 2。
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| A，results of Western blotting；B，analysis results of image J. *P < 0.05 vs control group. 1，control group；2，Jinlida group；3，acarbose group. 图 2 津力达颗粒对NF-κB等炎性细胞因子的影响 Fig.2 Effect of Jinlida granules on inflammatory cytokines |
3 讨论
DM是一种以长期慢性高血糖为主要特征的多因素诱导的代谢性疾病，通常是由于胰岛素分泌不足、糖类、脂质和蛋白质代谢紊乱所致[6]。降低血糖能够预防DM的发展。本研究发现，与空白对照组相比，不论是单次还是连续多次津力达颗粒灌胃，均能够在不影响体质量的前提下下调餐后2 h血糖，效果与阿卡波糖作用相近，且不会影响长期血糖的自我调节作用，对于DM的预防有一定作用。
血清TG是反映血脂的主要指标[7]，津力达颗粒连续灌胃能够降低血清内TG的含量，但是对TC和HDL-C等指标影响不明显，说明津力达颗粒能够调节血脂的水平，作用类似于阿卡波糖，但由于本研究所用实验动物为正常小鼠，故对反映血脂的其他指标的抑制并不明显。
氧化应激是自由基促氧化与机体抗氧化失衡造成的，与多种生理及病理过程密切相关。有报道指出，DM的发生与机体内自由基的增多及抗氧化防御系统功能的紊乱密切相关，氧化应激可以导致DM并发症的产生。SOD能够清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，对维持机体氧化平衡起重要作用。机体通过酶系统和非酶系统产生氧自由基，攻击生物膜中的多种不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，形成MDA等脂质过氧化物，因此，这些脂质过氧化物可以间接地反映细胞损伤的程度[8-9]。本研究中检测了津力达颗粒连续灌胃对小鼠SOD和MDA的影响，结果显示，津力达颗粒与阿卡波糖相近，均可显著降低小鼠体内的脂质过氧化水平。
血清中的BUN主要经肾小球滤过，并随尿液排出体外。当肾实质受损害时，肾小球滤过率降低，血液中BUN的浓度就会增加。Cr可作为内生肌酐清除率的必需指标用于评价肾脏功能，可以预测DM肾病的进展。蛋白质能够维持血液胶体渗透压，也与机体的免疫功能相关，测定血清中TP和ALB的含量可以了解机体的营养状况和免疫情况。血清中ALT和AST是反映肝细胞损害的最直接血清指标[10]。本研究发现津力达颗粒几乎不会造成小鼠的肝肾损伤，且对正常小鼠血清蛋白水平无显著影响。
LDH作为一种糖酵解酶，可以衡量机体的无氧代谢能力，当肌肉组织受到损害时，由于缺氧，代谢产物堆积，自由基增加，可导致细胞膜受损通透性增加，血清内LDH浓度上升。血清内LDH水平可以提示肌细胞是否受损，也能反映机体的运动能力[11-12]。本研究发现津力达颗粒能够下调血清内LDH水平，提示其对肌细胞具有一定的保护作用。
NF-κB活化可以促进多种炎性细胞因子的释放，造成组织细胞损伤，还可以增加诱导型一氧化氮合酶表达，增加一氧化氮合成，损伤胰岛β细胞，加速DM的进程[13]。IL-1β和IL-6作为反映炎症的主要因子，通常在DM患者体内表达上调[13]。本研究发现，津力达颗粒能够在一定程度上抑制NF-κB及IL-1β和IL-6的表达，抑制作用接近阿卡波糖，提示津力达颗粒能够减少组织细胞的损伤，抑制炎症的发生，减缓DM的发生发展。
综上所述，津力达颗粒能够在维持小鼠体质量、不损伤肝肾功能的前提下，降低餐后血糖浓度，抑制炎症反应，对于DM的预防具有积极的意义。
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