2019, Vol. 48文章信息
- 孙敬茹, 陈克研, 孙倩, 韩梅
- SUN Jingru, CHEN keyan, SUN Qian, HAN Mei
- 表没食子儿茶素没食子酸酯对糖尿病大鼠心脏的保护作用及对TGF-β1/Smad3信号通路表达的影响
- Protective Effect of Epigallocatechin Gallate on Diabetic Rat Hearts via TGF-β1/Smad3 Signaling Pathway
- 中国医科大学学报, 2019, 48(2): 119-123
- Journal of China Medical University, 2019, 48(2): 119-123
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文章历史
- 收稿日期：2018-05-08
- 网络出版时间：2019-01-02 15:54
引用本文 |
2. 中国医科大学实验动物部, 沈阳 110122
2. Department of Laboratory animal Science, China Medical University, Shenyang 110122, China
糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DC）是糖尿病的一种较常见的并发症，目前已经证明心肌异常和糖尿病之间存在因果关系。据统计，DC约占糖尿病患者的12%，并可能导致心力衰竭和死亡[1-3]。链脲佐菌素（streptozocin，STZ）对胰岛β细胞有细胞毒性作用，短期高糖高脂饮食联合STZ腹腔注射是目前较常用的诱导2型糖尿病动物模型的常用方法[4-6]。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是从绿茶中提取的儿茶素类单体，是茶多酚主要的活性和水溶性成份，是儿茶素中含量最高的组分[7]。因其特殊的化学结构，具有较强的抗氧化能力，目前主要用于抗肿瘤和预防心血管疾病[8]。本研究在建立2型糖尿病大鼠模型的基础上给予EGCG，观察其对糖尿病大鼠心肌损伤的保护作用，进一步探讨其对TGF-β1/Smad3信号通路表达的影响，为DC的防治奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物及分组清洁级SD大鼠，雄性，体质量200~220 g，由北部战区总医院实验动物科提供，通过实验动物福利伦理审查，动物自由饮食水。采用随机数字表法将动物平均分成4组，分别为假手术组（Sham组）、2型糖尿病心肌病模型组（DC组）、EGCG组[于糖尿病模型建立成功后，腹腔注射EGCG（100 mg/kg）28 d]和二甲双胍阳性对照组[Met组，于糖尿病模型建立成功后，每天给予大鼠二甲双胍灌胃（140 mg/kg），连续28 d]。
1.2 糖尿病大鼠模型建立大鼠饲喂高脂饲料8周。用0.1 mmol/L无菌枸橼酸缓冲液配置为6.5 g/ L、pH4.3的STZ溶液，腹腔注射40 mg/kg，72 h后检测血糖，血糖≥16.7 mmol/L认为造模成功。
1.3 样本采集与检测于给药28 d后用生理记录仪检测各组大鼠心脏功能，收集血液，一部分送检验科检测甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、糖化血红蛋白（blood hemoglobin ALC，HbAlc）和空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），另一部分分离血清用于ELISA检测。另取心脏组织样本，一部分固定于多聚甲醛中，剩余部分于-80 ℃冰箱保存。
1.4 ELISA检测为观察EGCG对DC氧化应激、心功能的影响，采用ELISA试剂盒（南京建成生物技术有限公司）检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde，MDA）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽过氧化酶（glutathione peroxidase，GPX）的含量，具体步骤参照说明书进行：在酶标板上加入标准品，依次倍比稀释；每孔加入血清样本100 μL，37 ℃温育60 min，洗涤液洗涤5次；每孔加入50 μL酶标二抗，37 ℃温育30 min；每孔加入显色剂A和B各50 μL，37 ℃避光显色15 min；每孔加入终止液50 μL；酶标仪检测450 nm处的吸光度值，绘制标准曲线，计算样品浓度。
1.5 Masson染色观察心肌组织甲醛固定组织48 h后，进行脱水、透明、浸蜡后对心肌组织进行石蜡包埋，将包埋好的心肌组织连续切片后，将切片脱蜡至水，用Regaud苏木精染液染色5 min，充分洗涤，盐酸乙醇分化3~5 s，用Masson丽春红酸性复红液染色5 min，以2%冰醋酸水溶液浸洗，1%磷钼酸水溶液分化3 min，光绿液染5 min；以0.2%冰醋酸水溶液浸洗，95%乙醇、无水乙醇、二甲苯透明、中性树胶封固。
1.6 Western blotting检测大鼠心肌组织中转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）、pSmad3和Smad3表达将心肌组织置于含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中，于冰上对心肌组织进行匀浆，收集上清液后，使用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量，对蛋白进行SDS-PAGE电泳、用PVDF膜转膜后，加入TGF-β1（ab92486），Smad3（ab40854），pSmad3（ab52903）抗体，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h后，使用ECL发光试剂盒和凝胶成像系统对蛋白进行显色，结果使用Image Tools进行吸光度分析。
1.7 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料采用x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 EGCG对DC大鼠血糖和血脂的影响与Sham组相比，DC组大鼠TG、TC、HbA1c和FBG水平显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；与DC组相比，EGCG组和Met组大鼠TG、TC、HbA1c和FBG水平显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
| Group | TG（mmmol/L） | TC（mmol/L） | HbA1c（%） | FBG（mmol/L） |
| Sham | 0.682±0.084 | 1.712±0.532 | 25.731±3.224 | 5.272±1.082 |
| DC | 1.374±0.0931） | 5.417±0.6721） | 39.853±2.8821） | 18.531±1.8841） |
| EGCG | 0.871±0.0672） | 3.212±0.4112） | 26.532±1.8312） | 6.742±0.9412） |
| Met | 0.822±0.0692） | 2.182±0.3412） | 25.984±2.1122） | 7.032±1.1162） |
| 1）P < 0.05，compared with Sham group；2）P < 0.05，compared with DC group. | ||||
2.2 EGCG对DC大鼠心脏功能的影响
与Sham组相比，DC组大鼠左心室舒张末期压力（left ventricular end dilated pressure，LVEDP）、左心室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）和左心室内压上升段/下降段最大变化速率（maximal rate of the increase/decrease of left ventricular pressure，±dp/dtmax）的绝对值均显著下降，差异有统计学意义（P < 0.05）；与DC组相比，EGCG组和Met组大鼠LVEDP、LVSP和±dp/dtmax的绝对值均显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。
| Group | LVEDP（kPa） | LVBP（kPa） | +dp/dtmax（kPa/s） | -dp/dtmax（kPa/s） |
| Sham | 1.573±0.075 | 19.732±1.231 | 1 562.342±184.531 | 1 348.921±219.413 |
| DC | 0.652±0.0841） | 12.842±1.4411） | 785.275±87.9311） | 681.937±73.4941） |
| EGCG | 1.273±0.0922） | 17.617±1.8242） | 1 242.280±113.1172） | 884.441±88.3232） |
| Met | 1.259±0.0772） | 17.942±1.6612） | 1 318.470±109.8422） | 949.821±98.7172） |
| 1）P < 0.05，compared with Sham group；2）P < 0.05，compared with DC group. | ||||
2.3 EGCG对DC大鼠血清SOD、MDA、CAT和GPX水平的影响
与Sham组相比，DC组大鼠血清中MDA水平显著升高，而SOD、CAT和GPX水平显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与DC组相比，EGCG组和Met组大鼠血清中MDA水平显著降低，而SOD、CAT和GPX水平显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 3。
| Group | SOD（kU/L） | MDA（μmol/L） | CAT（kU/L） | GPX（kU/L） |
| Sham | 607.531±27.832 | 2.131±0.292 | 658.542±19.231 | 556.812±12.394 |
| DC | 452.440±31.2261） | 7.577±0.2311） | 251.136±14.6541） | 301.180±16.8311） |
| EGCG | 533.430±28.9312） | 5.127±0.1732） | 339.837±16.8342） | 388.920±18.9422） |
| Met | 554.484±21.0402） | 4.994±0.2022） | 349.853±10.9312） | 406.810±15.3362） |
| 1）P < 0.05，compared with Sham group；2）P < 0.05，compared with DC group. | ||||
2.4 Masson染色
与Sham组相比，DC组大鼠心肌组织见大量胶原沉积，心肌纤维化程度较重；与DC组相比，EGCG组和Met组偶见少量胶原沉积，心肌纤维化程度明显改善，均趋于正常化。见图 1。
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| A, Sham group; B, DC group; C, EGCG goup; D, Met group. 图 1 Masson染色检测各组大鼠心肌组织病理学变化×200 Fig.1 Masson staining was used to detect pathological changes in the cardiac muscle tissues of the rats in each group ×200 |
2.5 Western blotting检测TGF-β1、pSmad3和Smad3蛋白表达
与Sham组相比，DC组心肌组织中的TGF-β1、pSmad3表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；与DC组相比，EGCG组和Met组TGF-β1、pSmad3蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；EGCG组和Met组TGF-β1、pSmad3蛋白表达相近，差异无统计学意义（P > 0.05）；各组Smad3表达差异均无统计学意义（P > 0.05），见图 2。
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| A, Western blotting; B, relative expression level of TGF-β1; C, relative activation level of pSmad3. * P < 0.05, compared with Sham group; # P < 0.05, compared with DC group. 1, Sham group; 2, DC group; 3, EGCG group; 4, Met group. 图 2 Western blotting法检测心肌组织中TGF-β1、pSmad3和Smad3蛋白表达水平 Fig.2 Western blotting analysis of the expression levels of TGF-β1, p-Smad3, and Smad3 proteins in rat cardiac muscle tissues |
3 讨论
研究[9]表明，高脂饮食合并STZ诱导的糖尿病大鼠会出现严重的心肌损伤，主要表现为心脏功能障碍、心肌氧化应激增加以及心肌纤维化。本研究利用Masson染色、ELISA和Western blotting等技术观察EGCG对大鼠心脏组织、血糖、血脂、心功能、氧化应激因子及TGF-β1/smad3通路蛋白表达的影响。结果提示，EGCG可以减轻糖尿病导致的心肌损伤，其机制可能与TGF-β1/smad3信号通路有关。糖尿病可以引起严重的心功能损伤，甚至导致心力衰竭和死亡。积极预防DC的发生发展一直都是急需解决的重点和难点。本研究为DC提供了实验理论依据。
糖尿病是一种胰岛素分泌绝对或相对不足的代谢性疾病，常常表现为以高血糖为典型特征的代谢紊乱，并伴随心脏、脑、肾脏等严重并发症，其中心血管并发症已经成为糖尿病主要死亡原因，其临床主要表现为心脏舒张和收缩功能障碍以及心肌结构的改变[10]。有研究[11]表明，DC患者体内氧化应激明显增强，是导致心肌收缩和舒张功能障碍的主要因素。本研究发现，模型建立后，大鼠出现严重的血脂异常和高血糖现象，心脏收缩和舒张障碍，心肌结构损伤严重，大鼠心脏和血清中氧化应激产物MDA含量明显增高，而抗氧化应激酶SOD、CAT和GPX显著降低。提示糖尿病可导致严重的心肌损伤和代谢紊乱，其可能与大鼠体内氧化应激增强有关。
EGCG是从绿茶中提取的一种主要的生物活性多酚，已被发现具有强效的抗氧化剂和自由基清除特性。EGCG对心血管功能具有多种有益作用，包括减少心肌损伤，减轻体外和体内缺血后心肌功能障碍。张妍淞等[12]研究发现，EGCG对阿霉素引起的心血管损伤具有显著的保护作用，其保护作用与降低心肌细胞凋亡，提高抗氧化防御和保护线粒体有关。本研究建立DC大鼠模型，予EGCG干预，发现EGCG可以缓解糖尿病导致的代谢紊乱，对心脏功能结构具有保护作用，能够抑制氧化应激反应。其对糖尿病大鼠心肌的保护作用可能与抑制氧化应激有关。
TGF-β作为调节细胞分化和生长的TGF-β超家族的成员，主要作用为促进成纤维细胞、成骨细胞和雪旺氏细胞的生长[13]。Smad3是TGF-β1/ Smad3信号通路激活的标志，已有研究[14]证实，TGF-β1/ Smad3信号通路途径可调节糖尿病大鼠的氧化应激水平。KO等[15]的研究表明，EGCG能改善慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺损伤，其作用机制与调控肺TGF-β /Smad3水平、抑制氧化应激和炎症反应有关。本研究建立2型糖尿病心肌病模型，心肌组织中TGF-β1、smad3表达升高，经EGCG干预后，TGF-β1、smad3蛋白表达显著降低。提示糖尿病所导致的心肌损伤可能与促进TGF-β1、smad3表达，增强氧化应激有关，而EGCG可以通过TGF-β1/Smad3信号通路途径介导氧化应激来保护糖尿病大鼠心肌损伤。
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