2019, Vol. 48文章信息
- 马珺, 姚一龙, 阮雪蕾, 沈书园, 邵连奇, 薛一雪
- MA Jun, YAO Yilong, RUAN Xuelei, SHEN Shuyuan, SHAO Lianqi, XUE Yixue
- circ-PTBP3对血肿瘤屏障通透性的影响
- Effect of circ-PTBP3 on the Permeability of Blood-Tumor Barrier
- 中国医科大学学报, 2019, 48(12): 1057-1062
- Journal of China Medical University, 2019, 48(12): 1057-1062
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文章历史
- 收稿日期：2018-12-19
- 网络出版时间：2019-12-06 9:02
引用本文 |
2. 中国医科大学附属盛京医院神经外科, 沈阳 110004
2. Deparment of Neurosurgery, Shengjing Hosipital, China Medical University, Shenyang 110004, China
脑胶质瘤是一种最常见的中枢神经系统恶性肿瘤[1]，预后不良。主要原因是由于血肿瘤屏障（blood-tumor barrier，BTB）的存在严重限制了大分子化疗药物进入肿瘤组织，影响治疗效果[2]。因此，有效地增加BTB的通透性是切实提高脑胶质瘤疗效的关键。
人类基因组绝大部分转录为非编码RNAs（non-coding RNAs，ncRNAs），ncRNAs对生命活动具有重要的调控作用[3]。环状RNAs（circular RNAs，circRNAs）是近年新发现的一类ncRNAs，存在于多种细胞，具有调控基因表达的作用[4]，与人类癌症的发生和发展密切相关[5]。研究[6]发现，在人脑胶质瘤组织中存在大量异常表达的circRNAs，这些异常表达的circRNAs可能参与胶质瘤的发生和发展。此外，缺氧可诱导内皮细胞中大量circRNAs表达水平的改变，提示circRNAs与血管功能密切相关。其中，circ-PTBP3（hsa_circ_0088072）在缺氧内皮细胞中高表达[7]，但circ-PTBP3在BTB功能中的作用尚未见报道。因此，本研究拟探讨circ-PTBP3对BTB功能的调控作用，以期为切实提高胶质瘤的治疗提供新靶点。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞人脑微血管内皮细胞（endothelial cells，ECs）系hCMEC/D3由Dr.Pierre-Olivier Couraud提供；人脑星形胶质母细胞瘤细胞系U87和人正常星形胶质细胞NHA购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。
1.1.2 试剂EBM-2（美国Lonza公司）；脂质浓缩物（美国Gibco公司）；胎牛血清、HEPES（美国PAA公司）；皮质醇（美国Sigma-Aldrich公司）；抗坏血酸（美国Sigma-Aldrich公司）；bFGF（美国Sigma-Aldrich公司）；Cultrex Rat CollagenⅠ（美国R & D公司）；Trizol（美国Thermo公司）；one-step PrimeScript RT-PCR Kit（日本Takara公司）；TaqMan Universal Master Mix Ⅱ（美国Thermo公司）；TaqManGene Expression Assays（美国Thermo公司）；RNase-R（美国Sigma-Aldrich公司）；lipofectamine LTX和Plus试剂（美国Thermo公司）；Lucifer yellow和FITC-Dextran（美国Sigma-Aldrich公司）；兔抗ZO-1多克隆抗体（美国Thermo公司）；小鼠抗occludin单克隆抗体（美国Thermo公司）；小鼠抗claudin-5单克隆抗体（美国Thermo公司）；小鼠抗GAPDH单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；ECL试剂盒（美国Santa Cruz公司）；Alexa Fluor 555标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔荧光二抗（中国碧云天生物技术公司）。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养hCMEC/D3细胞用含5%胎牛血清、1%青-链霉素、1.4 μmol/L皮质醇、1%化学定义脂质浓缩物、5 μg/mL抗坏血酸、10 mmol/L HEPES和1 ng/mL bFGF的EBM-2培养基培养于transwell小室上层（孔径0.4 μm，150 μg/mL Cultrex Rat CollagenⅠ处理）。人脑胶质母细胞瘤U87细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中。正常星形胶质细胞NHA培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中。用于本研究的ECs hCMEC/D3细胞在30~40代之间。所有细胞均置于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。
1.2.2 体外血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）与BTB模型的建立应用正常星形胶质细胞NHA和hCMEC/D3细胞共培养建立体外BBB模型，获得ECs；应用人脑胶质母细胞瘤细胞U87和hCMEC/D3细胞共培养建立体外BTB模型，获得脑胶质瘤微血管内皮细胞（glioma endothelial cells，GECs）。方法如下，用transwell小室（孔径0.4 μm）的下室，将U87或NHA细胞接种于6孔板中（2×104/孔），加入适量的培养液，培养48 h。然后，将hCMEC/D3细胞以2×105/孔的浓度接种于150 μg/mL Cultrex Rat CollagenⅠ处理的6孔transwell小室的上室，上下室均加入适量的EBM-2培养液，每2 d换液1次，共培养4 d[8]。
1.2.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）Trizol法提取总RNA，用Nanodrop分光光度计测定RNA浓度及OD260/OD280比值。总RNA反转录后，应用one-step PrimeScript RT-PCR Kit检测circ-PTBP3和PTBP3 mRNA表达水平（RNase-R处理用于确认circ-PTBP3的存在并排除线性RNAs的干扰）；应用TaqMan Universal Master MixⅡ和TaqMan Gene Expression Assays检测紧密连接相关蛋白[ZO-1（Hs01551861_m1）、occludin（Hs00170162_m1）、claudin-5（Hs00533949_s1）和GAPDH（Hs03929097_g1）]的表达。应用7500 Fast Real-Time PCR System测定Ct值，以2-ΔΔCt表示RNA的相对表达量。
1.2.4 细胞转染应用靶向circ-PTBP3的短发夹RNA序列连接到pGPU6/GFP/Neo载体上，构建circ-PTBP3表达沉默的质粒（sh-circ-PTBP3）。携带非靶向序列的质粒作为阴性对照（sh-NC）。以4×104/孔接种细胞于24孔板上，当细胞融合度达80%时，采用lipofectamine LTX和Plus试剂进行转染。4周后，G418抗性细胞克隆产生，用实时荧光定量PCR方法验证沉默效率。
1.2.5 跨内皮阻抗（transendothelial electric resistance，TEER）值的测量建立体外BBB和BTB模型，共培养第4天，将模型置于室温30 min后，应用millicell-ERS检测系统进行检测。每个样品的读数减去背景电阻值（包括transwell的微孔膜和培养液），并与transwell小室的表面积相乘，获得TEER值（Ω·cm2）。
1.2.6 通透性检测将transwell上下室培养液换为含有10 mmol/L HEPES和1 mmol/L丙酮酸钠的缓冲液，在上室缓冲液中加入50 mmol/L Lucifer yellow（LY，457）、50 mmol/L fluorescein isothiocyanate（FITC）-Dextran（4×103）或20 mmol/L FITC-Dextran（70×103）。使用Florescence multiwall plate reader分析，应用清除体积对时间作图，其曲线斜率为通透性系数。
1.2.7 Western blotting检测用含有1%PMSF的预冷RIPA蛋白裂解液提取总蛋白。SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，封闭2 h后，分别加入抗ZO-1抗体（1︰500稀释）、抗occludin抗体（1︰250稀释）、抗claudin-5抗体（1︰250稀释）和抗GAPDH抗体（1︰1 000稀释），4 ℃孵育过夜。用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG二抗孵育。ECL发光，用Microchemi仪器检测，ChemImager 5500 V2.03软件扫描，采用Fluorchem 2.0定量分析显色带的整合光密度值。
1.2.8 免疫荧光染色实验用冷丙酮固定细胞，室温封闭后，加入一抗4 ℃孵育过夜（1︰50稀释）。洗脱后，用Alexa Fluor 555标记的山羊抗小鼠或山羊抗兔荧光二抗（1︰500稀释）室温孵育2 h，洗脱后用0.5 μg/mL DAPI染核，甘油封片。应用荧光显微镜进行图像采集与分析。
1.3 统计学分析实验数据以x±s表示，采用SPSS 18.0统计软件进行分析。2组间比较采用Student’s t检验，3组及3组以上比较采用单因素方差分析和Dunnett’s post-test检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 circ-PTBP3在GECs中高表达应用人脑微血管ECs系hCMEC/D3与正常星形胶质细胞系NHA建立体外BBB模型，获得正常脑微血管ECs；应用人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3与胶质母细胞瘤细胞系U87建立体外BTB模型，获得GECs。应用qRT-PCR方法检测circ-PTBP3在ECs和GECs中的表达，如图 1所示，circ-PTBP3在GECs中的表达水平显著高于ECs（P < 0.01）。
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| Relative circ-PTBP3 expression in ECs and GECs. Data represent means ± SD (n = 5, each). *P < 0.01 vs ECs group. 图 1 circ-PTBP3在脑微血管内皮细胞中的表达水平 Fig.1 Expression of circ-PTBP3 in cultured brain endothelium |
2.2 RNase R处理后circ-PTBP3在GECs中高表达
为明确线性RNA linear-PTBP3是否参与BTB功能的调控，检测了PTBP3 mRNA在ECs和GECs中的表达水平。如图 2A所示，PTBP3 mRNA在ECs与GECs中的表达水平无统计学差异。RNase R可以降解线性RNA，却不能降解circRNA。用RNase R处理后检测circ-PTBP3在ECs和GECs中的表达水平，发现circ-PTBP3在GECs或RNase R处理后的GECs中高表达，且能抵抗RNase R的降解，其表达水平在GECs与RNase R处理后的GECs中无显著差异（图 2B）。
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| A, expression of linear PTBP3 in ECs and GECs; B, expression of circ-PTBP3 in ECs and GECs with RNase R treatment. Data represent means ± SD (n = 5, each). **P < 0.01 vs ECs group. 图 2 线性PTBP3 RNA的表达及RNase R处理后circ-PTBP3的表达情况 Fig.2 Linear PTBP3 expression and circ-PTBP3 expression with RNase R treatment in cultured brain endothelium |
2.3 沉默circ-PTBP3破坏BTB的完整性并增加其通透性
应用TEER值和通透性检测法检测circ-PTBP3表达沉默对BTB的完整性和通透性的影响。通过转染sh-circ-PTBP3质粒建立稳定表达sh-circ-PTBP3的细胞系，circ-PTBP3的沉默效率如图 3A所示，sh-circ-PTBP3组的circ-PTBP3表达水平较sh-NC组显著降低（P < 0.01）。sh-circ-PTBP3组的TEER值较sh-NC组显著降低（P < 0.01）（图 3B）。进一步检测BTB对不同分子量物质的通透性。如图 3C所示，sh-circ-PTBP3组对LY和4×103 FITC-dextrans的通透性较sh-NC组均显著增加（均P < 0.01），对70×103 FITC-dextran的通透性与sh-NC组相比无统计学差异（P > 0.05）。提示沉默circ-PTBP3可显著破坏BTB的完整性并增加其通透性。
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| A, relative circ-PTBP3 expression in sh-circ-PTBP3 stable expressing cells; B, the TEER values of BTB after circ-PTBP3 knockdown; C, the permeability coefficient values of LY (457), 4×103 FITC-dextrans and 70×103 FITC-dextran in BTB after circ-PTBP3 knockdown. Data represent means ± SD (n = 5, each). *P < 0.01 vs sh-NC group. 图 3 circ-PTBP3可调节BTB的完整性和通透性 Fig.3 circ-PTBP3 regulated the integrity and permeability of BTB |
2.4 沉默circ-PTBP3降低GECs中紧密连接相关蛋白的表达
应用Western blotting法检测ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白表达变化。结果显示，转染sh-circ-PTBP3组的ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白表达水平较sh-NC组显著降低（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.05）（图 4A）。紧密连接相关蛋白的免疫荧光结果显示，转染sh-circ-PTBP3组的ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白表达水平较sh-NC组显著降低。并且ZO-1和occludin位于GECs边缘，claudin-5位于细胞质。免疫荧光染色结果显示，sh-circ-PTBP3组ZO-1和occludin呈不连续性分布，claudin-5在细胞质中呈低表达状态（图 4B）。
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| A, Western blotting analysis of tight junction related proteins in GECs after circ-PTBP3 knockdown, using GAPDH as an endogenous control. Representative protein expression and their IDV are shown. Data represent means ± SD (n = 5, each). *P < 0.05 and **P < 0.01 vs sh-NC group. B, immunofluorescence staining of tight junction related proteins in GECs after circ-PTBP3 knockdown. Nuclei were labeled with DAPI. Images are representative of independent experiments (n = 5). Scale bar represents 20 μm. 图 4 circ-PTBP3可调节GECs紧密连接相关蛋白的表达 Fig.4 circ-PTBP3 regulated the expression of tight junction related proteins in GECs |
3 讨论
circRNAs普遍存在于真核细胞的基因组中，具有调控基因表达的作用。近年来发现circRNAs在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。越来越多的证据表明，circRNAs高度保守且稳定表达于细胞质[9]，它在胶质瘤组织中存在大量的异常表达，可能在胶质瘤的发生、发展等方面发挥调控作用，有望成为胶质瘤诊断和治疗的潜在靶标[6]。
近期有研究报道了circRNAs对胶质瘤细胞的调节作用，发现circ-MMP9在胶质瘤组织中高表达并可促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力[10]，circ-U2AF1可通过增加NOVA2的表达促进胶质瘤细胞的恶性行为[11]，circ-NFIX通过调节Notch1与Notch信号通路促进胶质瘤细胞的恶性行为[12]。此外，研究[7]发现缺氧可诱导ECs中大量circRNAs表达异常，提示circRNAs与血管功能密切相关。此外，还发现circ-SHKBP1在GECs中高表达，并可促进胶质瘤的血管新生[13]。以上提示circRNAs可能参与GECs功能的调控。研究[7]发现，circ-PTBP3（hsa_circ_0088072）在缺氧ECs中高表达。本研究结果证实，circ-PTBP3在GECs中高表达，提示，circ-PTBP3可能参与BTB微血管ECs功能的调控。
本研究证明，线性RNA linear-PTBP3在ECs和GECs中表达无差异。应用RNase R处理，降解了linear-PTBP3，未影响circ-PTBP3的表达。因此推测，circ-PTBP3与linear-PTBP3是2个相互独立的RNA，与circ-SHKBP1和circ-HIPK3相似[13-14]。有研究报道作为ncRNAs中的另一成员——lncRNAs可调控BTB屏障的通透性。沉默MIR17HG可降低紧密连接相关蛋白的表达，并增加BTB的通透性[15]；过表达MEG3通过负性调控miR-330-5p增加BTB的通透性[16]；沉默MALAT1可通过增加miR-140表达，增加BTB的通透性[17]。但目前尚未见circRNAs对BTB屏障通透性调控的报道。本研究沉默了circ-PTBP3，发现沉默circ-PTBP3可显著降低BTB的TEER值，增加BTB的通透性。BTB主要由肿瘤细胞和脑微血管ECs构成，相邻的脑微血管ECs之间的紧密连接是维持屏障完整性的重要结构和功能基础[18]。本研究组前期报道了紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5表达的下调，在通过细胞旁途径增加BTB通透性的过程中起关键作用[8, 17, 19-20]。因此，本研究中检测了紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达，发现沉默circ-PTBP3可显著减少ZO-1、occludin与claudin-5的表达与分布。以上研究结果提示，沉默circ-PTBP3可降低BTB的完整性并增加其通透性。
综上所述，本研究证明了circ-PTBP3在GECs中高表达，沉默circ-PTBP3可破坏BTB的完整性并增加BTB的通透性，减少紧密连接相关蛋白的表达。此作用机制的阐明可为胶质瘤的治疗提供新的靶点。
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