细胞凋亡是一种程序性进程，在发育分化及维持机体恒定等方面都发挥着重要作用，而肿瘤的发生发展究其根本即与凋亡的抑制和细胞的无限增值相关^[1-2]。凋亡素 (apoptin) 是由鸡贫血病毒 (CAV) 编码的一种功能蛋白, 可诱导所感染的靶细胞凋亡^[3]。随后的研究发现，凋亡素可选择性诱导肿瘤细胞凋亡, 但是对正常的二倍体细胞无损伤影响^[4]。

凋亡素除了具有广谱抗肿瘤的特性之外还有其他引起关注的优势：其诱导肿瘤细胞凋亡时不依赖于p53的介导，这样就不会发生肿瘤细胞因P53突变而产生的耐药性^[5]；同时该过程也不会被Bcl-2过度表达所抑制，一些研究表明共表达Bcl-2甚至可以提高凋亡素的诱导凋亡作用^[6-7]。随着研究的深入，凋亡素与Bcl-2的功能互作被证实与核孤儿受体Nur77相关，凋亡素可促进Nur77从细胞核转位到胞浆中，从而促进细胞色素C的释放，并启动一系列诱导基因的表达。而凋亡素的特异性诱导肿瘤细胞凋亡的机制，主要因为自身羧基端所包含的核定位信号，核定位信号只有在其108位丝氨酸残基被激酶磷酸化后才具备活性^[5-8]。因此，凋亡素只有在肿瘤细胞中才能定位于细胞核，并发挥抗肿瘤活性。凋亡素所具有的这些特点，使其成为一种极具潜力的肿瘤抑制剂，具有广阔的研究和应用前景^[9]。

研究表明，体外合成或基因工程表达的凋亡素可特异地引起多种人源性恶性肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长^[9-10]。但是在使用成本低产量高的原核表达系统进行表达时，凋亡素基因主要以包涵体形式表达，后续变性复性等步骤增加了操作流程并影响蛋白活性，且表达效率不高^[10-11]。因此，本文以CAV来源的apoptin基因为研究对象，在基因全序列3′端加入穿膜肽TAT序列，根据大肠杆菌密码子的偏爱性进行优化与合成，克隆入原核表达PBCX质粒并利用大肠杆菌BL21中进行诱导表达，借助msyB作为融合表达伴侣，旨在获得高效可溶表达的凋亡素蛋白，为更好地利用凋亡素作为抗肿瘤药物奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细胞系

人B淋巴瘤细胞系JEKO-1、REC-1以及人脐静脉内皮细胞系HUVEC均为本实验室保存。

1.1.2 菌株与质粒

质粒PBCX为华南农业大学谢青梅教授惠赠、Escherichia coli TOP10和E. coli BL21(DE3) 菌株由本研究室保藏。

1.1.3 试剂与试剂盒

PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶等购自大连TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自Axygen公司；His标记蛋白质纯化试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司；6×His标签单抗购自武汉三鹰生物科技公司；β-actin、P53、Caspase-3与Caspase-8单抗购自美国CST公司；CCK-8检测试剂盒购自南京凯基生物公司；依托泊苷购自Sigma公司；其它试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 序列组装与优化

本研究使用凋亡素 (apoptin) 序列是基于Genbank中鸡贫血病毒GD-12强毒株VP3 (GenBank序列号：JX260426) 的氨基酸序列，为了利于表达蛋白穿过作用细胞的细胞膜，于凋亡素氨基酸序列羧基端加入HIV-Tat蛋白的穿透肽序列“YGRKKRRQRRR”，并在凋亡素与穿透肽之间加入柔性氨基酸接头序列“GGGGS”，将组装好的所有序列根据Codon Usage Database中E. coli K12的密码子使用频率表，利用OPTIMIZER (http://genomes.urv.cat/OPTIMIZER/) 服务器进行密码子优化，在基因两端分别加上EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点送苏州泓迅生物科技有限公司进行合成并连接至pUC19质粒，获得pUC19-CAV-Apoptin-TAT。

1.2.2 重组质粒构建与菌株转化

将EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pUC19-CAV-Apoptin-TAT获得的基因片段与同样双酶切回收的表达载体pBCX使用T4 DNA-ligase进行连接，将连接产物转化E. coli BL21(DE3) 菌株，使用检测上游引物5′-TGTCGTGGTGACTGCTTCTG-3′和下游引物5′-TGGTCGGTACGCAAATCC-3′进行PCR菌液鉴定，经抗性筛选和质粒酶切鉴定检测分别筛选出重组子BL21/pBCX-Apoptin-TAT，将得到的重组子送上海生工公司进行测序分析。融合表达的蛋白序列结构如图 1所示，msyB为融合表达伴侣，pBCX载体改造步骤详见参考文献[12]中的“msyB标签与目的基因之间存在肠激酶裂解位点”。

1.2.3 重组凋亡素的诱导表达

将经测序鉴定后的BL21/pBCX-Apoptin-TAT菌液接种至4 ml的LB液体培养基中，37℃，220r/min下摇床培养；当OD₆₀₀为0.6~0.8时，加入终浓度为1 mmol/L IPTG进行诱导表达，以2 h为间隔，取0~6 h菌液，加入蛋白上样缓冲液，沸水中煮7~8 min后进行SDS-PAGE电泳。同时，设立空质粒pBCX/BL21诱导表达6 h菌液作为对照。由于msyB为pBCX载体的伴侣蛋白，故将载体表达的重组蛋白命名为msyB-CAV-Apoptin。

1.2.4 表达产物纯化与可溶性分析

以4%的接种量将BL21/pBCX-Apoptin-TAT菌种转接至100 ml新鲜的LB培养基中，以1.2.3同样条件使用IPTG诱导4 h。随后取出菌液，3 000r/min，4℃离心10 min，收集菌泥加入3 ml PBS，悬浮菌体；然后于冰浴中超声破碎，超声5 s, 间隔8 s，功率250w，超声50次，共重复6次，4℃于10 000r/min离心20 min；上清和沉淀分别取样进行SDS-PAGE检测；裂解上清液经一站式His标记蛋白质微量纯化套装获得纯化后的重组Apoptin-TAT。

1.2.5 表达产物的Western blot鉴定

将表达菌裂解上清进行SDS-PAGE检测，随后使用转膜仪进行半干转，15 V转膜20 min, 用5%脱脂奶粉室温封闭1h，采用6×His标签单抗完成Western blot分析。

1.2.6 表达产物的抗肿瘤活性

JEKO-1、REC-1、HUVEC细胞均使用RPMI-1640培养基 (含10%胎牛血清)，置37℃、5%CO₂培养箱中培养。处理前将各组细胞接种于96孔板，培养24 h后分别加入纯化后的融合蛋白药物50μl，使重组Apoptin-TAT终浓度为100μg/ml，同时设置纯化蛋白透析所用PBS缓冲液作为处理对照。随后将各组细胞置培养箱中继续培养，药物处理24 h后使用光学显微镜拍摄细胞凋亡形态，同时分别于12 h、24h及36 h按照CCK-8检测试剂盒说明书操作步骤加CCK-8，使每孔CCK-8终浓度为10%，继续培养1.5h后用酶标仪在450nm波长下测定每孔的吸光度 (A) 值，并计算抑制率，抑制率=(对照组A值-实验组A值/对照组A值)×100%。同时收获药物处理48 h的细胞抽提DNA，以1.2%琼脂糖凝胶电泳分析不同处理组染色体碎裂的片段化情况，为了有利于分析实验结果，使用依托泊苷 (20μg/ml) 处理JEKO细胞48 h作为凋亡阳性对照。

1.2.7 细胞凋亡关联的凋亡通路分子表达

收集重组蛋白与对照组PBS缓冲液处理的JEKO-1细胞，抽取总蛋白进行SDS-PAGE检测，随后使用转膜仪进行半干转，12 V转膜20 min, 用5%脱脂奶粉室温封闭1h，采用P53、Caspase-3与Caspase-8单抗完成Western blot分析，以β-actin作为内参对照。

2 结果 2.1 重组表达质粒的构建

分别将pBCX与含有密码子优化后凋亡素序列的pUC19-CAV-Apoptin-TAT质粒用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图 2a所示。pUC19-CAV-Apoptin-TAT酶切产物有两条清晰的条带，一条为pUC19质粒的片段，另一条为417 bp的目的基因的片段。将Apoptin-TAT条带与双酶切后的pBCX切割回收后用T4 DNA-ligase进行连接，转化BL21感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选后, 再进行PCR菌液鉴定，结果如图 2b所示。由电泳图可以看出，5个克隆菌均为阳性。为了进一步确定结果，对阳性菌落进行扩大培养，质粒抽提后进行酶切鉴定，鉴定结果如图 2c所示，结果显示利用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，包括417 bp目的基因的片段和空质粒片段，表明挑取的菌落均为阳性重组子，送苏州鸿迅进行测序鉴定，结果与预期的相符。将经测序鉴定的重组子分别命名为BL21/pBCX-Apoptin-TAT。

2.2 重组蛋白的表达、纯化及免疫原性分析

将挑取的阳性重组子BL21/pBCX-Apoptin-TAT进行诱导剂诱导表达，BL21/pBCX作为阴性对照，分别于诱导后0、2 h、4 h与6 h取1 ml菌液进行SDS-PAGE分析。最终收集50 ml发酵液中的菌体经碱裂解及中和后收集裂解上清，用一站式His标记蛋白质微量纯化套装进行纯化，最终分容至5 ml。将裂解上清液和纯化后的产物一并进行SDS-PAGE分析，结果如图 3所示。结果显示，重组子BL21/pBCX-Apoptin-TAT在37℃正常培养温度下为可溶性表达, 且表达量很高。同时，结果也表明经过His标签亲和层析后，获得了电泳纯的重组蛋白。利用考马斯亮蓝法测得纯化后的Apoptin-TAT的浓度为0.3 mg/ml，50 ml菌液获得的重组蛋白总量约为1.5 mg。免疫印迹实验结果表明重组表达的蛋白表达框正确，有免疫原性。

2.3 重组蛋白抑制细胞生长

按照1.2.6中的方法分析重组Apoptin-TAT对各细胞的生长抑制率，如图 4所示。随着药物作用时间的延长，重组蛋白对肿瘤细胞系JEKO-1、REC-1有明显的抑制作用。

2.4 重组蛋白诱导细胞凋亡

于显微镜下观察重组Apoptin-TAT处理24 h后的各组细胞，如图 5所示。结果表明，200×放大光镜下，JEKO-1和REC-1都出现了细胞破碎、胞浆析出以及颗粒裂解物，而各对照组细胞以及药物处理的HUVEC细胞都没有明显改变，说明重组Apoptin-TAT只诱导肿瘤细胞系JEKO-1、REC-1出现凋亡，而对正常细胞系HUVEC没有影响。

多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，细胞核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180~200bp或它的整倍数的各种片段。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180~200bp为基数的DNA ladder (梯状带纹) 的特征。本研究抽提重组Apoptin-TAT处理48 h后的各组细胞DNA并进行琼脂糖凝胶电泳分析，如图 6所示。结果表明，与依托泊苷处理的JEKO-1细胞相类似，重组Apoptin-TAT诱导JEKO-1和REC-1都出现了染色体断裂的核小体DNA ladders特征电泳图像，而各对照组细胞以及药物处理的HUVEC细胞没有出现，说明重组Apoptin-TAT只诱导肿瘤细胞系JEKO-1、REC-1出现凋亡，而对正常细胞系没有影响。

2.5 重组蛋白诱导凋亡通路分子表达

免疫印迹分析如图 7所示。结果表明，JEKO-1细胞经重组凋亡素蛋白处理后，活化的Caspase-3分子表达显著增加，而Caspase-8表达量与对照组细胞没有差别，P53在处理与对照组JEKO细胞都没有检测到表达 (没有在结果中显示)；说明重组凋亡素诱导的细胞凋亡基于线粒体凋亡途径而非死亡受体途径，为P53非依赖性。

3 讨论

目前研究中表达凋亡素主要通过以下几种方式：(1) 使用原核表达蛋白系统，利用穿膜肽进行蛋白输送^[10-13]；(2) 使用真核表达质粒DNA，使凋亡素在体内或体外进行表达^[14]；(3) 运用病毒系统，如腺病毒、慢病毒及新城疫病毒等，通过病毒转导外源凋亡素基因进行表达^[15-17]。尽管后两种方法使用真核细胞作为载体，表达的凋亡素具有生物活性好等优点。但作为临床使用药物的备选给药方式，使用病毒以及外源质粒DNA，都具有潜在的风险性, 且真核表达系统存在成本高得率低的问题。而使用基因工程手段进行体外重组蛋白的表达会安全得多，且运用原核表达系统，可低成本高效率地表达各种功能蛋白。凋亡素是一种胞内蛋白，不能直接透过细胞膜，只有进入肿瘤细胞内部才能表现出诱导凋亡活性^[18]。因此要通过外源表达的Apoptin发挥促凋亡作用，首先要能够有效地进入细胞内部，理想的方式是借助细胞穿透肽的运输作用，本研究在Apoptin序列后侧加入HIV-Tat蛋白的穿透肽序列，以利于蛋白的转位和发挥作用^[19]。

研究者已运用原核表达系统表达凋亡素蛋白开展了很多工作，张艳玲等^[10]报道利用pET28a载体于26 ℃诱导8h，获得包涵体形式的重组蛋白，且表达量不高；许鑫等^[11]将TAT-Apoptin序列构建入pGEX-6p-1载体，20 ℃诱导8h，获得部分可溶的表达产物，且表达量较低；而刘雪梅等^[20]将TAT-Apoptin序列构建入pET22b载体，20 ℃过夜诱导培养，表达产物可溶性提高，但同样存在表达量偏低的情况。本文将CAV-Apoptin的编码序列根据E. coli的密码子偏爱性进行了优化，利用带有msyB蛋白标签的pBCX质粒在37 ℃的条件下，仅用4 h就可获得高效可溶性表达的重组凋亡素蛋白。由此表明酸性蛋白标签msyB能够显著提高表达蛋白的可溶性，并且不用降低诱导表达的温度，可为其它类似蛋白的可溶性表达提供参考。

msyB是大肠杆菌中的一种酸性蛋白，研究者通过实验证明它是一种非常有效的蛋白可溶性标签，有助于重组蛋白高效可溶性表达，并有效地帮助靶蛋白的正确结构折叠以维持生物学活性，且分子量相对较小^[12]。为了在表达后去除蛋白伴侣，笔者运用肠激酶对融合表达的凋亡素重组蛋白进行切割，经过多次条件摸索都没有得到特异的切割产物；同时后续纯化会进一步增加实验成本和流程；结合本实验结果说明，融合表达的凋亡素蛋白已经具有理想的抗肿瘤活性。因此，本研究使用融合蛋白直接进行下游的活性研究。在后续的研究中，笔者也将进一步研究msyB蛋白标签对凋亡素蛋白活性的影响，努力改进非融合凋亡素的诱导表达。

致谢 感谢南阳师范学院研究生创新基金对本工作的支持。